Вспышка а: Регистратор автоматический температуры вспышки нефтепродуктов Вспышка-А

Регистратор автоматический температуры вспышки нефтепродуктов Вспышка-А


Регистратор автоматический температуры вспышки нефтепродуктов Вспышка-А


Производитель: Россия


Вспышка-А на сегодняшний день не имеет аналогов в мире, предназначена для регистрации температуры при вспышки нефтепродуктов в закрытом, а так же открытом тиглях, что делает его уникальным! Данное оборудование нашло широкое применение в атомной и нефтехимической промышленностях и является рекомендуемым, для своих лабораторий в Газпроме. Вспышка-А имеет много положительных отзывов от наших Заказчиков. По любым имеющимся вопросам, Вы можете уточнить по телефону 8 (495) 640-57-74 или на электронную почту [email protected] мы с радостью подберём Вам комплект, который на 100% выполнит поставленные задачи!


Прибор внесен в госреестр средст имерений РБ и РФ!


Один прибор вместо целой лаборатории.


— В соответствии с требованиями стандартов,  в регистратор встроен датчик давления, для измерения атмосферного давления при проведений анализа с учетом поправки в результате измерений.


— Вспышка-А – это уникальный прибор, полностью автоматический регистратор температуры вспышки нефетепродуктов в закрытом, так и в открытом тигле. На данный момент не имеет аналогов на рынке оборудования для регистраций температуры вспышки.


— Регистратор оснащен системой самодиагностики


— Автоматизирован процесс поджига ( электрический поджиг)


— В соответствии с требуемыми ГОСТАМи (ГОСТ 6356 ИСО 2719 а так же ГОСТ 4333 ИСО 2592), для оценки качества нефтепродуктов, был разработан один прибор – Вспышка-А, вместо целой лаборатории.


— Возможность редактировать и корректировать существующие программы с помощью встроенного редактора.


— Для минимализирования погрешности при определении температуры вспышки, была специально разработана и установлена полностью автоматизированная система контроля процесса, которая полностью исключает влияние оператора на результат.


— Вспышка-А оснащена дисплеем, который позволяет в режиме реального времени контролировать весь процесс.


— Программное обеспечение (поставляется с регистратором) позволяет анализировать самые разные продукты.


— Обновление программного обеспечения происходят удалённо, что позволяет значительно минимализаровать временные простои.


— Встроенная система регистрации и установленный термометр сопротивления (Pt-100 платиновый)


— RS232 порт


ГОСТ 4333-87


ГОСТ 6356-75


ГОСТ 22261-94


ГОСТ 4333-87


СТБ ИСО 2719-2002


ЕN ISO 2592-2000


EN ISO 2719-2002


Технические характеристики регистратора Вспышка-А











От 0 до 340


Диапазон измеряемых температур нефтепродукта,°С


От 70 до 280


Диапазон определения температуры вспышки в открытом тигле,°С


От 30 до 260


Диапазон определения температуры вспышки в закрытом тигле,°С





± 2


±5


±5


Пределы допускаемой абсолютной погрешности определения температуры вспышки, °С



— в закрытом тигле  по ГОСТ 6356 для проб с температурой вспышки


-до 104 °С включительно, °С


— свыше 104 °С, °С


в открытом тигле по ГОСТ 4333 (метод А)


От 5 до 6


Скорость нагрева пробы


16°С/мин


Объем пробы для испытаний, мл


120 Вт


Потребляемая мощность


290/290/160


Габаритные размеры, мм


12 кг


Масса



Стандартный комплект поставки:


  1. Регистратор

  2. Два тигля

  3. Два вкладыша

  4. Ухват

  5. Охладитель

  6. Сетевой кабель (шнур питания)

  7. Паспорт на прибор

  8. Методика поверки прибора ( копия)

  9. Оригинал (свидетельства первичной поверке)


Автоматический комбинированный регистратор ВСПЫШКА-А

Автоматический комбинированный регистратор температуры вспышки нефтепродуктов в открытом и закрытом тигле – ВСПЫШКА-А.

Регистраторы автоматические температуры вспышки нефтепродуктов «Вспышка-А» (далее по тексту – регистраторы) предназначены для определения температуры вспышки нефтепродуктов в открытом и закрытом тигле по ГОСТ 4333-87 и ГОСТ 6356-75, для определения температуры вспышки растительных масел в закрытом тигле согласно ГОСТ 9287-59 и для определения температуры вспышки нефтепродуктов и других жидкостей в равновесных условиях ускоренным методом согласно ГОСТ Р ЕН ИСО 2719-2008, ГОСТ Р ИСО 3679-2010 в лабораторных условиях.

Модификации аппарата “Вспышка-А”:

  • Модификация “Вспышка-А” предназначена для определения температуры вспышки нефтепродуктов в закрытом тигле по ГОСТ 6356 и открытом тигле по ГОСТ 4333 (метод А) в лабораторных условиях.
  • Модификация “Вспышка-Ар” предназначена для определения температуры вспышки нефтепродуктов и других жидкостей в закрытом тигле в равновесных условиях ускоренным методом согласно СТБ ISO 3679, СТБ ИСО 3679.

Технические характеристики

Предел основной абсолютной погрешности определения температуры вспышки
для закрытого тигля:
для проб с температурой вспышки до 104 °С включительно
для проб с температурой вспышки свыше 104 °С

не более 2 °С
не более 5 °С

Сходимость (повторяемость) результатов:
для открытого тигля
для закрытого тигля до 104 °С включительно
для закрытого тигля свыше 104 °С
±5 °С
±2 °С
 ±5 °С
Воспроизводимость результатов измерений:
для открытого тигля
для закрытого тигля до 104 °С включительно
для закрытого тигля свыше 104 °С
±16 °С
±4 °С
±8 °С
Диaпазон определяемых температур вспышки:
для закрытого тигля
для открытого тигля
30 … 260 °С
102 … 280 °С
Скорость нагрева пробы5 … 6 °С/мин
Масса, не более11 кг
Габаритные размеры300x270x180 мм

Автоматический регистратор температуры вспышки нефтепродуктов Вспышка-А

Данное оборудование указано в следующих разделах каталога:


Зарегистрирован в Государственном реестре средств измерений РФ под №1999256-00 и Беларуси ГР № РБ 03 10 0209 95 от 27.04.1995 г.


Назначение


Для определения температуры вспышки нефтепродуктов в открытом и закрытом тигле в автоматическом режиме


Модификации:


  • «Вспышка-А» для определения температуры вспышки нефтепродуктов в закрытом тигле по ГОСТ 6356 и открытом тигле по ГОСТ 4333 (метод А) в лабораторных условиях

  • «Вспышка-Ам» для определения температуры вспышки нефтепродуктов в открытом тигле по ГОСТ 4333 (метод А), закрытом тигле, ГОСТ 6356 и для определения температуры вспышки растительных масел в закрытом тигле согласно ГОСТ 9287 в лабораторных условиях

  • «Вспышка-Ар» для определения температуры вспышки нефтепродуктов и других жидкостей в закрытом тигле в равновесных условиях ускоренным методом согласно СТБ ISO 3679, СТБ ИСО 3679


Преимущества


  • Не имеет аналогов на мировом рынке аналитического оборудования

  • Объединяет в себе возможности двух ручных приборов ТВЗ и ТВО

  • Обеспечивает высокую скорость и точность оценки качества нефтепродуктов в открытом (ГОСТ 4333, ИСО 2592) и в закрытом тигле (ГОСТ 6356, ИСО 2719)

  • Небольшой объем пробы (16 мл)


Основные особенности


  • автоматическая установка скорости нагрева (5…6 °С/мин) и начала поджига в зависимости от выбранного режима работы;

  • индикация текущей температуры и температуры вспышки нефтепродуктов на табло буквенно-цифрового индикатора;

  • индикация выбранного режима на табло;

  • индикация работы нагревателя;

  • световая индикация и звуковая сигнализация по окончании опыта;

  • ускоренное определение предполагаемой температуры вспышки.


Принцип действия регистратора


Основан на методе, заключающемся в нагреве пробы нефтепродукта в открытом или закрытом тиглях с установленной скоростью до вспышки паров нефтепродукта над его поверхностью и фиксацией температуры вспышки.


Регистратор состоит из металлического корпуса, внутри которого находится блок нагревателя и поджига, выпрямительный блок, понижающий трансформатор, и блоков электроники и термостатирования.


Блок нагрева и поджига в свою очередь состоит из разрядника высоковольтной искры, измерительной термопары, термопары фиксации момента вспышки, нагревателя, двигателя, посредством которого осуществляется ввод и вывод тигля с пробой нефтепродукта в рабочую камеру, вкладышей для организации режима «открытый» и «закрытый» тигель.


На передней панели корпуса находятся клавиши управления и дисплей для отображения температуры нагрева и режима работы.


Технические характеристики




















Тип исполнения

автомат

Тигль

закрытый, открытый

Объем пробы, мл

16

Предел основной абсолютной погрешности определения температуры вспышки для закрытого тигля, °С, не более

для проб с температурой вспышки до 104 °С включительно

2

для проб с температурой вспышки свыше 104 °С

5

Сходимость (повторяемость) результатов, °С

для открытого тигля

±5

для закрытого тигля до 104 °С включительно

±2

для закрытого тигля свыше 104 °С

±5

Воспроизводимость результатов измерений, °С

для открытого тигля

±16

для закрытого тигля до 104 °С включительно

±4

для закрытого тигля свыше 104 °С

±8

Диапазон определяемых температур вспышки, °С

для закрытого тигля

30…260

для открытого тигля

102…280

Скорость нагрева пробы, °С/мин.

5…6

Питание, В/Гц

220/50

Мощность максимальная, Вт

700

Габаритные размеры, мм

300×260×180

Масса, кг

11

Организация меню управления фотовспышками Sony Alpha

Колонка эксперта

Александр Бахтурин


Преподаватель отдела маркетинга, эксперт компании Sony

Самым захватывающим фактором в общении с новейшими цифровыми фотокамерами Sony (A6500/6300/A7M3/A7RM3/A9) оказывается настройка экранного меню. Однако практика показывает, что 80 процентов пользователей за первые 6 месяцев работы с камерой этого не делают.

Таким образом, по многочисленным просьбам фотографов, мы решили показать, как организовано меню в моих камерах на примере экранного меню Sony Alpha 7R III. Все советы мы разделили на тематические статьи, каждая из которых посвящена соответствующему разделу меню.

В этот перечень также включен материал, посвященный настройкам вспышки. Я рассматриваю все три категории (варианта использования) вспышек — встроенные, накамерные, беспроводные. Это означает, что я затрагиваю в том числе модели RX-10/RX-100, которые оснащены встроенной вспышкой, а не только входящие в серию Sony Alpha, с которыми совместимы накамерные осветительные приборы.

Как и в случае с камерами, я делаю обзор меню и даю свои рекомендации. В данном случае я пишу этот текст с дополнительными устройствами в руках. И читать его будет удобно лишь так же — станет видна логика переходов и управления. Иначе это «китайская грамота». Весь список материалов, входящих в цикл, представлен ниже.

«Звёздочка/Мое меню»; «Качество/Размер изображения»; «Режим съёмки/Работа затвора»; «Экспозиция»; «Фокусировка»; «Цвет/Баланс белого/Обработка изображения»; «Вспышка»; «Помощь при фокусировке»; «Помощь при съемке»; «Видео»; «Затвор/SteadyShot»; «Увеличение»; «Отображение/Автопросмотр»; «Настройки (Чемодан)»; «Сеть и воспроизведение»; «Пользовательские операции»; «Пользовательские клавиши»; «Пользовательское меню».

На камере Sony Alpha 7 III установленна флагманская высокоскоростная вспышка HVL-F60RM.

Встроенная вспышка

В разделе меню камеры «Баланс белого» следует сразу выставить режим «Вспышка».

Доступны следующие режимы встроенной заполняющей вспышки. Она может быть «выключена», несмотря на то, что поднята! Включена в «Авто». Включена в заполняющий режим – объект получится ярче фона, но фон может быть чёрным.

Синхронизация с медленными скоростями затвора – фон прорабатывается, но объект будет ярче фона.

Синхронизация по задней шторке — срабатывание происходит на длинной выдержке перед закрытием затвора, это дает возможность получения фотографии проезжающего автомобиля со следом стоп-сигналов сзади.

Компактная камера Sony RX100 VI премиум-класса оснащена встроенной вспышкой.

Коррекция импульса вспышки +/- 3Ev – важный инструмент управления яркостью бликов при портретировании.

Уменьшение эффекта «красных глаз». В этом режиме производится 3-4 коротких вспышки малой мощности перед рабочим импульсом вспышки. Они должны повлиять на расширенный зрачок глаза, аккомодированного к условиям низкой освещённости для предотвращения отражения света от кровеносных сосудов задней поверхности глаза портретируемого. Таким образом, предвспышки заставляют зрачки сузиться. Кстати, если человек находится в нетрезвом состоянии, то в этом грустном случае работа предвспышек, увы, бесполезна.

Встроенные вспышки в камерах Sony Alpha и RX можно наклонять руками. На них можно устанавливать огромное количество (самодельных) рассеивающих и светоформирующих насадок.

Накамерная вспышка

В разделе меню камеры «Баланс белого» следует также сразу выставить режим «Вспышка».

Включаем на вспышке режим высокоскоростной синхронизации — «HSS On».

Возможны следующие режимы работы — TTL, Manual, Multi, Group или «Выкл.».

В меню можно выбрать командный режим работы (CMD) или ведомый (RMT).

Следует заметить, что импульс командной вспышки можно включать и выключать.

При наличии режима Radio control его также можно включить/выключить.

Когда овладеете режимами вспышки в достаточной степени, я очень рекомендую использовать память настроек M1/M2.

Возможен режим автозума или ручное управление зумом.

Меню флагманской высокоскоростной вспышки HVL-F60RM. Возможны следующие режимы работы — «Выкл.», TTL, Manual, Multi, Group.

Pairing — беспроводная связь с управляющим/ведомым устройством, старт поиска.

Paired device — выбор связанного устройства.

WL ready lamp ON — включение мигания светодиода, который подтверждает готовность к беспроводному управлению. Лично я, когда становлюсь уверен в работе, с удовольствием выключаю эту функцию.

Ratio — управление мощностью между группами, в каждой из которых может быть до пяти вспышек.

Важно отметить, что управление мощностью вспышки (Ratio) невозможно осуществлять с камеры — только с самой вспышки или с коммандера.

Беспроводная вспышка

В меню камеры следует установить режим вспышки — «Беспроводная»; баланс белого — «Вспышка».

Затем в меню вспышки устанавливаем: «Беспроводная связь с управляющим/ведомым устройством, старт поиска устройства».

Включаем на вспышке режим высокоскоростной синхронизации — «HSS On».

Меню флагманской высокоскоростной вспышки HVL-F60RM. Здесь можно растраивать беспроводную связь с управляющим/ведомым устройством — Pairing.

Возможны следующие режимы работы — TTL, Manual, Multi, Group или «Выкл.».

В меню можно выбрать командный режим работы (CMD) или ведомый (RMT).

При наличии режима Radio control его также можно включить/выключить. Управление мощностью (Ratio) с камеры не работает, только со вспышки/коммандера.

Pairing — это беспроводная связь с управляющим/ведомым устройством. Старт поиска: включить одновременно на ведомой вспышке и коммандере/ведущей вспышке.

Add — добавление нового устройства в список.

List — список добавленных устройств с возможностью удаления.

Cоединённые устройства одновременно зажигают зелёный сигнальный светодиод связи Link на коммандере/ведущей вспышке, после этого становится доступна подсвеченная кнопка «Тест». Reciever set — проверить опознанность ведомой вспышки и принадлежность её к управляемой группе.

Ratio — управление мощностью между группами, в каждой из которых может быть до пяти вспышек.

Узнать больше о вспышках Sony: https://www.sony.ru/electronics/fotoapparati-so-smennimi-obektivami/t/aksessuari

похожие статьи

Заполняющая вспышка — Canon Russia

Большинство режимов съемки камер EOS подходят для работы с заполняющей вспышкой. Здесь вы узнаете, как именно выбрать подходящий режим.

• Полностью автоматический режим (интеллектуальный сценарный режим). Как уже говорилось ранее, в полностью автоматическом режиме встроенная вспышка активируется, когда системы камеры считают это необходимым. То есть в условиях слабого освещения или контрового света. Он подходит, если вы спешите или вам нужен быстрый и простой способ съемки с заполняющей вспышкой. Однако он ограничивает творческие возможности.

• Программный режим (P). Отлично подходит для базовой работы с заполняющей вспышкой. Как и в полностью автоматическом режиме, настройки выдержки и значение диафрагмы задаются автоматически, но вы можете выбрать — использовать вспышку или нет. Если вы подняли встроенную вспышку, то она сработает. В других случаях она не сработает. Вы также можете установить Speedlite на камеру и включить ее.

В режимах «Полностью автоматический» и «Программный режим» (P) выдержка со вспышкой ограничена в диапазоне от 1/60 секунды до скорости синхронизации вспышки (от 1/90 до 1/250 секунды в зависимости от модели камеры). Этот надежный механизм встроен в наши новые камеры, чтобы предотвратить искажение изображения, вызываемое сотрясением камеры при более длительной выдержке. В большинстве случаев вы увидите, что на камере выбрана более длительная выдержка. Более высокое значение выдержки может пригодиться лишь при очень ярком дневном свете. Однако для заполняющей вспышки показатель 1/60 секунды подходит идеально.

• Режим приоритета выдержки (Tv). В режиме приоритета выдержки (Tv) вы можете выбрать значение выдержки, а значение диафрагмы будет задано автоматически в соответствии с экспозицией дневного света. Камера не позволит вам выбрать значение выдержки выше, чем скорость синхронизации вспышки камеры, — если вы попытаетесь сделать это, оно автоматически поменяется на значение скорости синхронизации.

• Режим приоритета диафрагмы (Av). Идеально подходит для творческого применения заполняющей вспышки. В режиме приоритета диафрагмы (Av) вы выбираете значение диафрагмы, а остальное устанавливается автоматически. На камере EOS R и всех камерах EOS, выпущенных после нее, в режиме приоритета диафрагмы используется уже упомянутый в описании полностью автоматического и программного режимов механизм, ограничивающий диапазон значений выдержки. В камерах предыдущих моделей можно было задать значение до 30 секунд. Диафрагма — один из основных факторов, определяющих глубину резкости (уровень резкости до точки фокусировки и после).

Однако у вас нет полного контроля над диафрагмой. Если в солнечный день выбрать максимальную диафрагму, могут возникнуть проблемы с автоматическим подбором значения выдержки для правильной экспозиции дневного света. В результате получится изображение с передержкой. Чтобы этого избежать, перед съемкой проверьте значение выдержки, указанное в видоискателе. Если значение мигает, значит вы превысили диапазон, то есть стоит выбрать более закрытую диафрагму.

Если выбрать слишком закрытую диафрагму, то камера установит длительную выдержку, в частности, если света солнца недостаточно для правильной экспозиции. Значение экспозиции должно оказаться верным, но при длительной выдержке может понадобиться использование штатива для защиты от сотрясения камеры.

• Ручной режим (M). Позволяет установить значения выдержки и диафрагмы независимо от камеры, сохраняя при этом полную автоэкспозицию вспышки. Данный режим полезен для некоторых приемов использования вспышки, но не подходит для создания заполняющего света. Большинство комбинаций значения выдержки и диафрагмы не обеспечат нужный баланс между светом вспышки и дневным светом. Вместо этого используйте режим приоритета диафрагмы (Av).

В приложении Камера не работает вспышка

Выполните следующие действия.

1. Вспышка выключена

Чтобы использовать вспышку при съемке фото, откройте приложение Камера и выберите режим для вспышки (Авто, Выкл., Вкл. или Всегда вкл.).

Если выбран режим Авто, вспышка будет автоматически включаться или выключаться в зависимости от уровня яркости окружающего освещения.

2. Низкий уровень заряда батареи

Убедитесь, что уровень заряда батареи телефона достаточный. Когда уровень заряда батареи менее 15%, вспышка автоматически выключается. Зарядите телефон, чтобы уровень заряда батареи был более 15%, и повторите попытку.

3. Телефон или вспышка перегревается

Вспышка может не включаться, если телефон перегревается или вспышка используется слишком часто в течение короткого периода времени. Подождите немного и повторите попытку.

4. Вспышка используется другим приложением

Проверьте, не запущены ли в фоновом режиме приложения для сканирования кода и не используется ли вспышка. Вспышка может единовременно использоваться только одним приложением. Закройте эти приложения и повторите попытку.

5. Камера не поддерживает вспышку

Проверьте, какой режим съемки вы используете — он может не работать со вспышкой. Например, вспышка не работает при использовании режимов Отрезок времени и Свет.

6. Удалите данные приложения Камера

Удалите данные приложения Камера и повторите попытку. Откройте Настройки, найдите и откройте раздел Приложения, а затем перейдите в раздел .

При удалении данных приложения Камера будут удалены только настройки и данные, установленные и созданные во время использования. Ваши видео и фото не будут удалены.

7. Если проблема сохраняется

Если проблема не устранена, сохраните резервную копию данных и обратитесь в авторизованный сервисный центр Huawei.

О компании ВСПЫШКА, радиооборудование, оборудование для спецавтотранспорта

Компетенция экспертов компании «ВСПЫШКА» позволяет предложить нашим партнерам и клиентам оптимальные и технически выверенные решения

   История компании «ВСПЫШКА» неотрывно связана с ее техническими специалистами, экспертами и настоящими профессионалами в сфере высокотехнологичных радио и видео устройств и профессионального оборудования для спецавтотранспорта. А началось все в 2006 году, когда команда молодых специалистов решила создать на рынке принципиально новую компанию, профессионально работающую как на узкопрофильном направлении продаж и установки оборудования для спецавтотранспорта, так и на высокотехнологичном рынке радио и видео оборудования (цифровые рации, профессиональные радиостанции). Были сформированы основные принципы и стандарты качества оказания услуг и продаж, построенные на высочайшей технике исполнения и максимальной клиентоориентированности. Такая стратегия, ставшая драйвером роста, позволила утверждать, что на сегодняшний день каждый сотрудник компании «ВСПЫШКА» — эксперт в своей области. Это профессионалы с большим опытом работы, понимающие потребности наших клиентов и их ожидания от успешного сотрудничества с нашей компанией.

   Блестящий союз высококачественного оборудования, представленного в линейке нашей компании, и компетентности специалистов позволяет удовлетворять самые притязательные требования наших заказчиков из МВД, ФСБ, МЧС, Министерства здравоохранения. Ведь они уверены, что компания «ВСПЫШКА»- одна из немногих на рынке средств радиосвязи и безопасности, где технологии продаж и концепция оказания услуг доведены до совершенства.

   Коммерческим организациям мы предлагаем конкурентное преимущество в виде функциональных и высокотехнологичных решений с лучшей комбинацией цена/качество.

   Частным заказчикам специалисты нашей компании готовы предложить полный спектр услуг по установке охранных систем и сигнализаций, светосигнального оборудования, фар-вспышек, блоков управления СГУ, специального аудио оборудования на автомобили, словом все, до чего додумалась автомобильная инженерная мысль.

   Вся товарная линейка, представленная в компании «ВСПЫШКА», была тщательно отобрана, протестирована и объективно оценена экспертами нашей компании. Такой подход позволил предложить нашим партнерам и клиентам, как дорогостоящие эксклюзивные решения, так и практичное и недорогое радио, видео и спецоборудование, отвечающее современным стандартам качества. Исходя из данной концепции, специалистами нашей компании был доработан и запущен в производство электромегафон ГЛАС-35.

   Наша компания успешно сотрудничает с известными мировыми и российскими компаниями, работающими на рынке радиосвязи и спецоборудования для автотранспорта. Мы являемся авторизованным дистрибьютором «Промышленная компания «ЭЛИНА», являющейся лидером на рынке разработок и производства сигнальной техники для спецавтотранспорта, а также представляем в России известные американские и европейские бренды, такие как SoundOff Signal, 3М. В области продаж раций и аксессуаров для радиостанций компания «ВСПЫШКА» является золотым партнером Motorola Solutions , а также мы предлагаем профессиональные рации и цифровые радиостанции таких известных брендов, как ICOM, Kenwood, Hytera, Yaesu, Alinco, Racio, Lira, Vector. Помимо радиостанций наши специалисты предлагают оптимальные решения в области систем видеонаблюдения.

Мы испытываем чувство гордости от сотрудничества с такими компаниями как:

Определение Flash по Merriam-Webster

\ вспышка

\

вспыхнул; мигает; мигает

непереходный глагол

2

: вспыхивать или как внезапное пламя или вспышка

: появиться внезапно

идея вспыхивает в ее голове

б

: двигаться с большой скоростью

дни проносятся мимо

: вспыхивать или выходить внезапно

б

: действовать или говорить резко и внезапно, особенно в гневе

: испускать свет внезапно или кратковременными вспышками

б

: светиться или мерцать, особенно от оживления или страсти

ее глаза вспыхнули гневом

6

: внезапно или резко превратиться в пар

7

: обычно внезапно и ненадолго обнажать грудь или гениталии на публике

8

: внезапное озарение

—Часто используется с

переходный глагол

б

: заполнить при внезапном притоке воды

: вызвать внезапное появление (света)

б

: вызвать бурное возгорание

с (1)

: заставлять (свет) отражаться

(2)

: заставлять (что-то) отражать свет

засветить зеркало

(3)

: заставить (лампу) мигать

d

: передать с помощью вспышек света

: сделать известными или вызвать появление с большой скоростью

высветить сообщение на экране

б

: показывать навязчиво и демонстративно

всегда мигает пачка банкнот

c

: открывать для просмотра обычно внезапно и на короткое время

мигал значок

4

: покрыть или сформировать тонким слоем: например,

а

: для защиты от дождя, накрыв листовым металлом или заменителем

б

: покрыть (стекло) тонким слоем (как металл, так и стекло другого цвета)

5

: подвергнуть (экспонированный фотографический негатив или позитив) дополнительную равномерную экспозицию на свету перед проявкой, чтобы изменить детали или тон

6

: обычно внезапно и ненадолго обнажать грудь или гениталии

мелькнула аудитория

: внезапная вспышка света

б

: движение флага в сигнализации

2

: внезапная и часто яркая вспышка

вспышка остроумия

: показать, показать

особенно

: пошлая показная демонстрация

б
архаичный

: эффектный показной человек

c

: тот, который привлекает внимание

особенно

: выдающийся спортсмен

5
устаревший

: воровской сленг

c

: первый краткий новостной репортаж

е

: быстро распространяющееся пламя или кратковременная интенсивная вспышка лучистого тепла

(2)

: устройство для изготовления фонарика для фотографирования.

8

: быстрое превращение жидкости в пар

б

: относящиеся к ярким людям или вещам, относящиеся к ним или их характеристики

поведение вспышки

c

: относящиеся к лицам, считающиеся социальными изгоями, или характерные для них

язык прошивки

2

: внезапного происхождения и непродолжительности

вспышка огня

3

: наличие или использование твердотельной технологии хранения данных, которая сохраняет данные даже без подключения к источнику питания

флэш-память

: при очень кратковременном воздействии сильного изменяющего агента (например, тепла или холода)

мгновенное замораживание

Познакомьтесь с дедушкой Флэшем, пионером фотографии дикой природы

В прошлом месяце архивист National Geographic Билл Боннер поделился со мной красивой книгой «В сердце темной ночи», посвященной работе фотографа Джорджа Шираса.Как новый фоторедактор в журнале, я не был знаком с его работами. Ширас, который начал фотографировать в 1889 году, считается отцом фотографии дикой природы — он был первым, кто использовал фотоловушки и вспышку при фотографировании животных.

В 1906 году National Geographic опубликовал 74 его фотографии, а в 1928 году Ширас пожертвовал Обществу 2400 своих стеклянных негативов. Они остаются в нашем архиве сегодня.

Рысь на берегу озера Лун, недалеко от озера Ванапитеи, Онтарио, Канада, июль 1902 г.

Пожалуйста, соблюдайте авторские права.Несанкционированное использование запрещено.

Дикобраз-альбинос на плавающем бревне, озеро Уайтфиш, регион Верхнего озера, Мичиган, 1 июля 1905 г.

Пожалуйста, соблюдайте авторские права. Несанкционированное использование запрещено.

«В сердце темной ночи» (и соответствующая выставка, которая сейчас демонстрируется в Париже) редактировала и курировала Соня Восс, которая приехала в National Geographic, чтобы работать с Боннер над выбором изображений из архива. National Geographic отсканировал оригинальные стеклянные пластины, которые раньше никогда не сканировались.Некоторые из табличек датированы 1897 годом, имеют повреждения и царапины. La Chambre Noire в Париже отретушировала изображения с использованием традиционных техник, включая пятнистость, уклонение и выжигание.

«Когда я впервые обнаружил фотографии Шираса, я был поражен их красотой и жуткостью. Но помимо поэтического элемента, который исходит из этих картин, есть кое-что еще », — сказала мне Восс в недавнем интервью по электронной почте, объединив свои личные размышления с цитатами из своей книги. «Их экспериментальный и целеустремленный характер отличает их от изображений некоторых художников и фотографов 19-го века с их изображениями ностальгической, идеализированной природы, нетронутой и аутентичной.”

Джордж Ширас и его помощник Джон Хаммер на борту их оборудованного подъемником каноэ, озеро Уайтфиш, регион Верхнего озера, Мичиган, 1893

Пожалуйста, соблюдайте авторские права. Несанкционированное использование запрещено.

Джордж Ширас родился в 1859 году в Аллегейни, штат Пенсильвания, и в детстве увлекался охотой. Он работал юристом и политиком, когда начал фотографировать дикую природу, а затем посвятил свою жизнь фотографированию животных в Мичигане и окрестностях озера Верхнее.Он стал ярым защитником дикой природы и инициировал создание нескольких национальных парков и убежищ.

«Изначально Ширас развивал свои фотографические занятия как способ ответить на зов дикой природы вне сезона охоты», — писал Восс. «Но его восхищение красотой природы и его приверженность защите видов быстро превратили его в самого ярого защитника« охоты на камеру »».

Белохвостая лань на берегу реки Уайтфиш, регион Верхнего озера, Мичиган , дата неизвестна

Пожалуйста, соблюдайте авторские права.Несанкционированное использование запрещено.

Снежная сова сидит над рекой Уайтфиш, регион Верхнего озера, штат Мичиган, около 1900 г.

Пожалуйста, соблюдайте авторские права. Несанкционированное использование запрещено.

Чтобы сфотографировать ночью, Ширас имитировал технику охоты, которую он узнал от племени оджибва, под названием «световой огонь», когда огонь помещается в кастрюлю в передней части каноэ, а охотник сидит на носу лодки.

«Свечение позволяет различить животное, внимание которого привлекает пламя, заставляя его стоять на месте с выжидательным видом», — пояснил Восс.«В задней части каноэ, отброшенный в тень охотник должен только прицелиться между глазами животного, которые отражают пламя и выделяются, как два ярких маяка в ночи. В фотографической версии огонь заменяется керосиновой лампой, а спусковой крючок винтовки — спуском затвора фотоаппарата ».

Лось в тумане, Миннесота, 1909

Пожалуйста, соблюдайте авторские права. Несанкционированное использование запрещено.

Медведь гризли, Йеллоустонская долина, Монтана, 1908 г.

Пожалуйста, соблюдайте авторские права.Несанкционированное использование запрещено.

Чтобы сфотографировать животных вдали от береговой линии, Ширас установил фотоловушки, используя подвешенную веревку или веревку, которые, когда их потревожили, приводили в действие вспышку, и дистанционно управляемую камеру, которую Ширас разработал с помощью сложной системы проводов. Ширас назвал этот метод захватом фонарика. «В то время фотография со вспышкой была еще совсем новой и создавалась путем взрыва порошка магния», — писал Восс. «Можно только представить детонацию, вызванную взрывом, вместе с интенсивной яркостью, подобной огненному шару, который, по словам Шираса, вызвал в воображении загадочную« пылающую луну ».’”

Енот снято с помощью фотографической ловушки, северо-восточный берег озера Уайтфиш, регион Верхнего озера, Мичиган, 1903 г.

Пожалуйста, соблюдайте авторские права. Несанкционированное использование запрещено.

«Ширасу, — писал Восс, — фотография, усиленная ее последними достижениями, была незаменимым средством для раскрытия неизведанного и подтверждения красоты мира, находящегося под угрозой исчезновения. То, как он рассматривал фотографию не только с эстетической точки зрения, но и как средство документирования природы и формирования нового отношения к ней, имеет большое историческое значение и проложило путь к долгой истории фотографии дикой природы.”

Выставка« Джордж Ширас, В сердце темной ночи »будет открыта в Музее Шасс и природы в Париже до 14 февраля 2016 года. На выставке представлены старинные гравюры из National Geographic и DeVos Art. Музей в Маркетте, штат Мичиган. Публикацию In the Heart of the Dark Night, издаваемую Editions Xavier Barral, можно приобрести здесь.

Мигание окна 101 — Как правильно прошить окно

Мигание окна — важный компонент любой постройки или реконструкции дома.Слишком много людей забывают или просто не знают, как правильно мигать окно, поэтому мы подумали, что дадим вам небольшое введение в основы мигания окна. Если у вас есть какие-либо вопросы о мигании окон в конце этого руководства, обязательно обратитесь к руководству производителя вашего окна или позвоните в команду Zeeland Lumber & Supply, чтобы получить небольшую помощь. Приступим:

Что такое мигание окна?

Оконная планка — это атмосфероотталкивающий материал, который устанавливается вокруг оконного блока для защиты окна и оконной рамы от повреждения водой.

Когда устанавливается Window Flashing?

Оконная планка устанавливается одновременно с оконным блоком. Обычно прошивка окна — это двухэтапный процесс. Первая половина мигания окна происходит, когда вы или ваш строитель готовите черновой проем для установки окна. Вторая половина мигания окна происходит после того, как оконный блок закреплен и возведен в квадрат внутри грубого проема.

Термины для мигания окон, которые необходимо знать перед началом работы:

  • Капельный колпачок — Алюминиевая насадка, устанавливаемая на самом верху оконного блока.Работает, чтобы вода не просачивалась и не скапливалась в верхней части оконного блока. Сводит к минимуму вероятность повреждения водой.
  • Гидроизоляционный слой — Водоотталкивающий клей, который наносится на фланцы окон и обшивку для герметизации любых потенциальных утечек внутри окна или вокруг него.
  • Головка косяка — Вершина грубая проем. Именно сюда идет верх оконного блока при установке.
  • Косяки — Вертикальные стороны оконного проема.
  • Черновой проем — Проем слева за окном, когда дом был обрамлен.Он выглядит как открытый квадрат в рамной стеновой панели и имеет специальные усиления, чтобы правильно удерживаться в оконном блоке. Узнайте больше об основах обрамления и черновых проемах здесь.
  • Порог — Нижний край оконного чернового проема. Это то, на что опирается оконный блок при установке.
  • Оконный блок — Окно целиком, от рамы, которая удерживает все компоненты окна, до створки и стекла, обеспечивающих функционирование окна. Все вместе эти части составляют единый оконный блок.
  • WRB — Погодостойкий барьер, также известный как обертка для дома. Это тонкий, устойчивый к атмосферным воздействиям лист материала, который оборачивают вокруг дома перед установкой окон, облицовки или сайдинга. Это дает вашему дому еще один уровень защиты от непогоды.

Как устанавливается Window Flashing?

Каждый производитель окон предлагает особые инструкции по окладу оконного блока. В зависимости от типа окна, его конструкции и формы, оклейка окна может происходить в несколько различных этапов.По возможности всегда лучше следовать инструкциям производителя. Чтобы дать вам общее представление о процессе оклейки окон, вот основные пошаговые инструкции по установке окантовки для прямоугольного окна в жилом доме.

1. Сокращение WRB (атмосферостойкий барьер)

a) Ваш WRB должен быть завернут в грубый проем окна. Когда вы будете готовы установить оконный блок
, вы сократите WRB.

b) Сначала сделайте вертикальный разрез в WRB в центре оконного проема, от верха проема до низа
.Затем сделайте горизонтальные надрезы в верхней и нижней части оконного проема, потянув эти две боковые створки
назад из проема и закрепив их небольшим куском ленты.

c) Сделайте надрезы под углом 45 градусов от углов в верхней части чернового проема. Когда вы сложите и скотчете клапан
в верхней части грубого отверстия, у вас должно получиться что-то похожее на это.
(Фото любезно предоставлено Marvin Windows)

2. Установить планку подоконника.

a) При установке планки подоконника или планки в нижней части окна у вас есть несколько вариантов материала
. Вы можете использовать клейкую ленту и клеящуюся планку, или вы можете выбрать поддон заданной формы, который поможет
собирать воду и безопасно направлять любые сточные воды из вашего дома. На этой инструкции для Marvin
Windows показан еще один вариант — комбинация подоконника и самоклеющейся планки.

b) Выберите вариант вспышки на пороге, рекомендованный вашим производителем.При использовании оконной планки
с отклеиванием и залипанием убедитесь, что планка простирается на всю длину подоконника и не менее чем на шесть дюймов с любой стороны оконного проема
.

3. Закончив обшивку подоконника, оберните боковые панели WRB вокруг внутренней части грубого проема и закрепите, как
, показанное на рисунке (b).

4. Нанести герметик

.

a) Теперь, когда WRB закреплен и подоконник установлен, можно нанести небольшую полоску герметика для подготовки оконного блока
.

b) Не наносите герметик на дно или подоконник чернового проема окна. Нижняя часть окна
должна оставаться открытой, чтобы вода не попадала внутрь оконного блока.

c) Нанесите герметик на верхнюю и боковые стороны оконного проема. Начните дюйма от угла с каждой стороны,
и остановитесь на ¾ дюйма от конца каждой стороны. Это позволит любой воде, которая действительно попадает в устройство, легко вытечь и
без повреждений. Если вы заклеите все вокруг каждого угла, вода будет задерживаться в оконном блоке и может вызвать плесень и гниль древесины.

5. Установить оконный блок.

a) На этом этапе вы можете установить оконный блок. Следуйте инструкциям производителя или ознакомьтесь с этим блогом, чтобы получить дополнительную информацию о правильной установке оконного блока
. Убедитесь, что окно ровное и квадратное, прежде чем
завершит оклад вашего окна.

6. Изолируйте оконный блок.

a) Следуйте инструкциям производителя, используя расширяющуюся пену или изоляцию из стекловолокна.

7. Нанесите защитную пленку и оклейку на оконные косяки, выступая за подоконник и на 4–5 дюймов выше верхней части окна
.

8. Если на вашем окне есть каплеуловитель, самое время его установить.

a) Верхний косяк окна наиболее уязвим для повреждения водой. Вот почему многие производители поставляют со своими окнами колпачки для капель
. Капельницы крепятся к обшивке прямо над окном и немного выступают на
, чтобы вода не попала в оконный блок. Если на ваших окнах нет каплеуловителей, вы можете приобрести их у местного поставщика
или сделать свои собственные с алюминиевой катушкой и кожухом и палочкой.

b) Установите капельницу в соответствии с инструкциями производителя. Большинство окон, которые поставляются с крышками для сбора капель, изготовлены по типу
таким образом, что крышка для сбора капель удобно помещается в верхней части окна. Если вы используете свой собственный колпачок
, просто приклейте кусок прямо над окном, чтобы вода стекала со стены и оконного блока
на стекло вашего окна.

9. Нанести косяк в головку и закончить.

а) Последний шаг — нанесение косяка в головку.Эта полоса мигания должна проходить горизонтально через верхнюю часть оконного блока
, выступая, по крайней мере, на шесть дюймов за оконные косяки.

b) После этого вы можете откинуть верхнюю заслонку WRB, приклеить скотчем, и все готово.

На этом этапе вы закончили работу с окном, и ваше окно готово для облицовки и сайдинга.

Оконные планки — важный этап в процессе строительства дома. Слишком много людей не знают или забывают правильно мигать окна, что может привести к дорогостоящему ущербу от воды в вашем доме.Выполнив эти простые шаги и потратив немного больше времени на установку окон, вы можете гарантировать, что дом, который вы строите или реконструируете, водонепроницаем и безопасен на долгие годы.

Готовитесь установить окна в новом доме или сделать ремонт? Zeeland Lumber & Supply может помочь! У нас есть все необходимые материалы, от первоклассных оконных материалов до простого клея для отрывания и наклеивания. Начните свой следующий проект правильно — получите все необходимое в Zeeland Lumber & Supply.Чтобы получить необходимые вам материалы для оконной перемычки, позвоните нам по телефону (888) 772-2119 или зайдите в один из наших офисов сегодня.

Flash: Создание Weegee the Famous | Кристофер Бонанос

* Лучшая книга по искусству 2018 года по версии New York Times и Библиотечного журнала, Лучшая книга 2018 года по версии Newsday и Town & Country, а также Лучшая книга подарков к празднику Star Tribune и Globe and Mail *

«Кристофер Бонанос наконец-то представил с биографией, которую заслуживает Виджи: сочувственный и исчерпывающий, скрупулезный отчет с правильной ноткой непочтительности.Бонанос … серьезно относится к фотографу, не позволяя ему и его самомифологизму сорваться с крючка. — The New York Times

«[] Выдающаяся биография … Бонанос — бесподобный путеводитель по карьере Уиджи, написанный с очевидным удовольствием и глубоким пониманием». —Newsday

«Быстро написанная жизнь Уиджи Знаменитого… [] прекрасная биография» — The Wall Street Journal

«Вииджи и его мир не поощряют минимализм, и, через пятьдесят лет после его смерти, он наконец-то приобрел биографа, который может не отставать от него.»- Томас Мэллон, житель Нью-Йорка

» Постоянно увлекательно… глубоко исследовано… убедительно. «- Обзоры Киркуса, * Звездный обзор *

« Анализ времени, фотографий и техник новостного фотографа, а также его публичности- голодный персонаж, это биография, которую заслуживает псевдоним Артур Феллиг — самопровозглашенный «официальный фотограф Murder Inc.». — The Globe and Mail

«Вырез и резкость яркой прозы Бонаноса отражают суровые условия Нью-Йорка середины двадцатого века, в то время как жизненно важные детали, почерпнутые из его обширных исследований, оживляют портрет…он делает человека, стоящего за камерой, полностью человеком ». — Список книг, * Ста … Подробнее…

* Лучшая книга по искусству 2018 года по версии New York Times и Library Journal, Лучшая книга 2018 года по версии Newsday и Town & Country, а также Лучшая книга подарков к праздникам от Star Tribune, Globe and Mail *

«Кристофер Бонанос наконец-то предоставил нам книгу биография Weegee заслуживает: сочувственного и исчерпывающего, скрупулезного отчета с правильным оттенком непочтительности. Бонанос … серьезно относится к фотографу, не позволяя ему и его самомифологизму сорваться с крючка.«Нью-Йорк Таймс,
,
». «Выдающаяся биография … Бонанос — бесподобный путеводитель по карьере Уиджи, написанный с очевидным удовольствием и глубоким пониманием». —Newsday

«Быстро написанная жизнь Уиджи Знаменитого… [] прекрасная биография» — The Wall Street Journal

«Вииджи и его мир не поощряют минимализм, и, через пятьдесят лет после его смерти, он наконец-то приобрел биографа, который может не отставать от него «. —Томас Мэллон, житель Нью-Йорка

«Постоянно увлекательно… глубоко исследовано… убедительно.»- Обзоры Киркуса, * Обзор с пометкой *

» Анализ времен, фотографий и техник новостного фотографа, а также его жаждущего рекламы персонажа, это биография псевдонима Артура Феллига — самопровозглашенного официального фотографа для Murder Inc. »- заслуживает». — The Globe and Mail

«Вырез и резкость яркой прозы Бонаноса отражают суровые условия Нью-Йорка середины двадцатого века, в то время как жизненно важные детали, почерпнутые из его обширных исследований, оживляют портрет…он делает человека, стоящего за камерой, полностью человеком ». — Список книг, * Обзор с пометкой *

« [A] Превосходная биография … Бонанос тщательно исследовал каждый аспект жизни Уиджи, заполнив этот увлекательный и живой рассказ забавными и трогательными анекдотами . » —Library Journal, * Обзор с пометкой *

«[] безупречно исследованная биография… Бонанос предлагает живую историю первых лет новостной фотографии, богатую анекдотами, которые создают образ Уиджи». —PopMatters.com

«Великолепная биография Кристофера Бонаноса показывает, как человек, рожденный как Ашер Феллиг в 1899 году, заново открыл себя как летописец мрачных сторон ночного Манхэттена 1930-х годов.«- The Seattle Times

« [A] смелый, волнующий портрет »—BoweryBoysHistory.com

« Живой… давно назревший и бесконечно интересный ». — The Santa Fe New Mexican

« [A] энергичная и информативная биография … Разоблачительный портрет Бонаноса «Weegee the Famous» заинтересует обычных читателей, а также тех, кто особенно интересуется фотожурналистикой ». —Publishers Weekly

«Артур« Уиджи »Феллиг, возможно, был идеальным средством для того, чтобы определить и передать страх и чудеса современного города нашему американскому духу.Журналист, художник и торговец, Уиджи украл осколки Нью-Йорка через объектив камеры, а затем воссоздал великий город в мозаике, которая каким-то образом — несмотря на изрядную степень мошенничества — все еще определяет для нас саму урбанистику. Мы знаем фотографии, и теперь, благодаря биографии Кристофера Бонаноса, мы, наконец, можем кое-что узнать о легендарном, невероятном и много карикатурном человеке », — Дэвид Саймон, создатель сериалов« The Wire »и« Двойка »HBO

« Flash — это потрескивающий портрет человека и его эпохи — такой же непосредственный и живой, как сами картины Уиджи.Крис Бонанос оживляет не только его тему, но и давно потерянный Нью-Йорк, в котором он жил, и это сделало его ». — Дэниел Окрент, автор бестселлеров New York Times« Последний звонок: рост и падение запрета »

« Weegee, in Помимо того, что он был одним из величайших фотографов, он был мультипликационным персонажем и чем-то вроде живого мифа. Это приводило к путанице в восприятии на протяжении большей части восьмидесяти лет. Детализированный и отзывчивый отчет Кристофера Бонаноса сумел объединить эти три аспекта — не только был много бахвальства по-настоящему, но даже чистая чепуха была добыта с трудом и контекстуально обоснована.Это милая и меланхоличная книга, открывающая путь в прошлое, о котором в большинстве своем забывают ».
— Люк Санте, автор книги «Низкая жизнь: приманки и ловушки старого Нью-Йорка»

«В автокатастрофе есть что-то такое, что заставляет людей замедляться, когда они проезжают мимо. То же самое и с фотографиями Уиджи. Может, мне не хотелось бы его знать, но было бы интересно с ним познакомиться. И эта увлекательная биография Кристофера Бонаноса оживляет суровый старый Нью-Йорк, где он жил и работал.Он был легендарным персонажем, чьи работы вдохновляли молодых людей, таких как я ». — Синди Шерман, художник

— Меньше…

Показывает A-Z — вспышка, по часовой стрелке

дата (день) раз сеть название серии
21.07.21 (Вт) 20:00 The CW TBA
29.06.21 (Вт) 20:00 The CW TBA
22.06.21 (Вт.) 20:00 The CW TBA
15.06.21 (Вт) 20:00 The CW TBA
08.06.21 (Вт) 20:00 The CW TBA
01.06.21 (Вт) 20:00 The CW TBA
25.05.21 (Вт) 20:00 The CW TBA
18.05.21 (Вт.) 20:00 The CW Оригинальная серия
21.05.21 (Вт) 20:00 The CW TBA
21.05.21 (Вт) 20:00 The CW (# 708) The People V. Killer Frost
27.04.21 (Вт.) 20:00 The CW (# 707) Боли роста (R)
20.04.21 (Вт.) 20:00 The CW (# 706) The One With The Nineties (R)
13.04.21 (Вт.) 20:00 The CW (# 707) Проблемы роста
06.04.21 (Вт.) 20:00 The CW (# 706) The One With The Nineties
30.03.21 (Вт) 20:00 The CW (# 705) Бойся меня
23.03.21 (Вт) 20:00 The CW (# 704) Central City Strong
16.03.21 (Вт.) 20:00 The CW (# 703) Мать
21.03.21 (Вт) 20:00 The CW (# 702) Скорость мысли
21.03.21 (Вт) 20:00 The CW (# 701) Все колодцы, которые заканчиваются колодцами
23.02.21 (Вт.) 20:00 The CW (# 701) Все колодцы, которые заканчиваются колодцами
12.05.20 (Вт.) 20:00 The CW (# 619) Успех гарантирован
05.05.20 (Вт) 20:00 The CW (# 618) Pay the Piper
28.04.20 (Вт.) 20:00 The CW (# 617) Liberation
21.04.20 (Вт.) 20:00 The CW (# 616) До свидания и спокойной ночи
14.04.20 (Вт.) 20:00 The CW (# 615) Экзорцизм Нэша Уэллса (R)
8.04.20 (ср.) 20:00 The CW (# 609) Кризис на бесконечных землях: часть третья (R)
31.03.20 (Вт) 20:00 The CW (# 613) Grodd Friended Me (R)
31.03.20 (Вт) 20:00 The CW (# 616) До свидания и спокойной ночи
24.03.20 (Вт.) 20:00 The CW (# 612) Девушка по имени Сью (R)
17.03.20 (Вт) 20:00 The CW (# 615) Экзорцизм Нэша Уэллса
10.03.20 (Вт.) 20:00 The CW (# 614) Death of the Speed ​​Force
03.03.20 (Вт) 20:00 The CW (# 611) Love Is A Battlefield (R)
03.03.20 (Вт.) 20:00 The CW (# 614) Death of the Speed ​​Force
25.02.20 (Вт) 20:00 The CW (# 613) Grodd Friended Me
18.02.20 (Вт) 20:00 The CW (# 612) Девушка по имени Сью
11.02.20 (Вт) 20:00 The CW (# 611) Love Is A Battlefield
04.02.20 (Вт.) 20:00 CW (# 610) Марафон
13.01.20 (Пн) 20:00 The CW (# 609) Кризис на бесконечных землях: Часть третья (R)
10.12.19 (Вт.) 20:00 The CW (# 609) Кризис на бесконечных землях: часть третья
03.12.19 (Вт.) 20:00 The CW (# 608) Последнее искушение Барри Аллена, Pt.2 (**)
03.12.19 (Вт.) 20:00 The CW (# 608) Последнее искушение Барри Аллена, Pt. 2
26.11.19 (Вт.) 20:00 The CW (# 607) Последнее искушение Барри Аллена, Pt. 1
19.11.19 (Вт.) 20:00 Лицензия CW (№ 606) на удлинение
12.11.19 (Вт) 20:00 The CW (# 601) Into the Void (R)
05.11.19 (Вт.) 8:00 PM The CW (# 605) Поцелуй Поцелуй Breach Breach
29.10.19 (Вт.) 20:00 The CW (# 604) Там будет кровь
22.10.19 (Вт.) 20:00 The CW (# 603) Мертвец бежит
15.10.19 (Вт.) 20:00 The CW (# 602) Вспышка молнии
08.10.19 (Вт.) 20:00 The CW (# 601) В пустоту
08.07.19 (Пн) 21:30 The CW (# 508) Что прошлое — это пролог (R)
02.07.19 (Вт) 20:00 The CW (# 522) Наследие (R)
25.06.19 (Вт) 20:00 The CW (# 521) Девушка с красной молнией (R)
18.06.19 (Вт.) 20:00 The CW (# 520) Gone Rogue (R)
11.06.19 (Вт) 20:00 CW (# 519) Snow Pack (R)
04.06.19 (Вт.) 20:00 The CW (# 518) Godspeed (R)
28.05.19 (Вт.) 20:00 The CW (# 517) Бомба замедленного действия (R)
21.05.19 (Вт.) 20:00 The CW (# 516) Отказ — сирота (R)
14.05.19 (Вт.) 20:00 The CW (# 522) Наследие
07.05.19 (Вт) 20:00 The CW (# 521) Девушка с красной молнией
30.04.19 (Вт.) 20:00 The CW (# 520) Gone Rogue
23.04.19 (Вт) 20:00 CW (# 519) Snow Pack
16.04.19 (Вт.) 20:00 The CW (# 518) Godspeed
09.04.19 (Вт.) 20:00 The CW (# 515) King Shark Vs. Горилла Гродд (R)
02.04.19 (Вт) 20:00 The CW (# 514) Причина и XS (R)
26.03.19 (Вт) 20:00 The CW (# 513) Goldfaced (R)
19.03.19 (Вт) 20:00 The CW (# 517) Бомба замедленного действия
12.03.19 (Вт.) 20:00 The CW (# 516) Отказ — сирота
05.03.19 (Вт.) 20:00 The CW (# 515) King Shark vs. Gorilla Grodd
26.02.19 (Вт) 20:00 The CW (# 511) Seeing Red (R)
19.02.19 (Вт.) 20:00 The CW (# 510) The Flash & The Furious (R)
12.02.19 (Вт.) 20:00 The CW (# 514) Причина и XS
05.02.19 (Вт) 20:00 The CW (# 513) Goldfaced
29.01.19 (Вт) 20:00 The CW (# 512) Памятные вещи
22.01.19 (Вт) 20:00 The CW (# 511) Seeing Red
22.01.19 (Вт) 20:00 The CW (# 511) Seeing Red (*)
15.01.19 (Вт.) 20:00 The CW (# 510) Флэш и яростный
1/7/19 (Пн) 20:00 The CW (# 509) Elseworlds, Part 1 (R)
01.01.19 (Вт.) 20:00 The CW (# 508) Прошлое — пролог (R)
09.12.18 (вс.) 20:00 The CW (# 509) Elseworlds, Part 1
04.12.18 (Вт.) 20:00 The CW (# 508) Прошлое — пролог
27.11.18 (Вт.) 20:00 The CW (# 507) О Приходите, все благодарные
27.11.18 (Вт.) 20:00 The CW (# 507) Приходите, все верные
27.11.18 (Вт.) 20:00 The CW (# 507) Приходите, все верные (*)
20.11.18 (Вт.) 20:00 The CW (# 506) The Icicle Cometh
13.11.18 (Вт) 20:00 The CW (# 505) All Doll’d Up
06.11.18 (Вт) 20:00 The CW (# 501) Нора (R)
30.10.18 (Вт.) 20:00 The CW (# 504) Новости Flash
23.10.18 (Вт) 20:00 The CW (# 503) Смерть Vibe
16.10.18 (Вт.) 20:00 The CW (# 502) Заблокировано
09.10.18 (Вт) 20:00 The CW (# 501) Нора
02.10.18 (Вт) 20:00 The CW (# 423) We Are The Flash (R)
25.09.18 (Вт) 20:00 The CW (# 422) Think Fast (R)
18.09.18 (Вт) 20:00 The CW (# 408) Кризис на Земле-X, часть 3 (R)
11.09.18 (Вт.) 20:00 The CW (# 420) Следовательно, она (R)
04.09.18 (Вт) 20:00 The CW (# 419) Fury Rogue (R)
28.08.18 (Вт) 20:00 The CW (# 418) Lose Yourself (R)
21.08.18 (Вт) 20:00 The CW (# 417) Нулевой и раздраженный (R)
14.08.18 (Вт.) 20:00 The CW (# 416) Беги, радужка, беги (R)
26.06.18 (Вт) 20:00 The CW (# 405) Girls Night Out (R)
19.06.18 (Вт) 20:00 The CW (# 404) Продолжительное путешествие в ночь (R)
12.06.18 (Вт) 20:00 The CW (# 403) Luck Be a Lady (R)
05.06.18 (Вт.) 20:00 The CW (# 402) Смешанные сигналы (R)
29.05.18 (Вт) 20:00 The CW (# 401) The Flash Reborn (R)
22.05.18 (Вт.) 20:00 The CW (# 423) We Are The Flash
15.05.18 (Вт) 20:00 The CW (# 422) Think Fast
08.05.18 (Вт.) 20:00 The CW (# 421) Гарри и Харрисоны
01.05.18 (Вт) 20:00 The CW (# 420) Следовательно, она
24.04.18 (Вт) 20:00 The CW (# 419) Fury Rogue
17.04.18 (Вт) 20:00 The CW (# 418) Lose Yourself
10.04.18 (Вт.) 20:00 The CW (# 417) Нулевой и раздраженный
03.04.18 (Вт) 20:00 The CW (# 416) Беги, радужка, беги (R)
27.03.18 (Вт) 20:00 The CW (# 415) Enter Flashtime (R)
20.03.18 (Вт) 20:00 The CW (# 414) Тема 9 (R)
13.03.18 (Вт.) 20:00 The CW (# 416) Беги, радужка, беги
06.03.18 (Вт) 20:00 The CW (# 415) Enter Flashtime
27.02.18 (Вт) 20:00 The CW (# 414) Тема 9
20.02.18 (Вт) 20:00 The CW (# 410) Испытание Флэша (R)
13.02.18 (Вт.) 20:00 The CW (# 409) Не беги (R)
06.02.18 (Вт) 20:00 The CW (# 413) True Colors
30.01.18 (Вт) 20:00 The CW (# 412) Дорогая, я сократил командную вспышку
23.01.18 (Вт) 20:00 The CW (# 411) The Elongated Knight Rises
16.01.18 (Вт.) 20:00 The CW (# 410) Испытание Флэша
09.01.18 (Вт) 20:00 The CW (# 408) Кризис на Земле-X, часть 3 (R)
1/2/18 (Вт) 20:00 The CW (# 407) Следовательно, я (R)
26.12.17 (Вт.) 20:00 The CW (# 406) Когда Гарри встретил Гарри… (R)
05.12.17 (Вт.) 20:00 The CW (# 409) Не бегать
28.11.17 (Вт) 20:00 The CW (# 408) Кризис на Земле-X, часть 3
28.11.17 (Вт) 20:00 The CW (# 408) Кризис на Земле X, часть 3
21.11.17 (Вт.) 20:00 The CW (# 407) Поэтому я
14.11.17 (Вт.) 20:00 The CW (# 406) Когда Гарри встретил Гарри…
07.11.17 (Вт) 20:00 The CW (# 405) Girls Night Out
31.10.17 (Вт) 20:00 The CW (# 404) Продолжительное путешествие в ночь
24.10.17 (Вт.) 20:00 The CW (# 403) Luck Be a Lady
17.10.17 (Вт.) 20:00 The CW (# 402) Смешанные сигналы
10.10.17 (Вт) 20:00 The CW (# 401) The Flash Reborn
03.10.17 (Вт.) 20:00 CW (№ 323) Финишная линия (правая)
26.09.17 (Вт.) 20:00 The CW (# 322) Infantino Street (R)
19.09.17 (Вт.) 20:00 The CW (# 321) Причина и следствие (R)
9/12/17 (Вт) 20:00 The CW (# 320) Я знаю, кто вы (R)
05.09.17 (Вт.) 20:00 The CW (# 319) The Once and Future Flash (R)
29.08.17 (Вт.) 20:00 The CW (# 318) Абра Кадабра (R)
22.08.17 (Вт.) 20:00 The CW (# 317) Duet (R)
15.08.17 (Вт.) 20:00 The CW (# 316) Into the Speed ​​Force (R)
08.08.17 (Вт.) 20:00 The CW (# 315) Гнев Савитара (R)
01.08.17 (Вт) 20:00 CW (№ 314) Атака на Центр города (R)
25.07.17 (Вт.) 20:00 The CW (# 313) Атака на Город Гориллы (R)
18.07.17 (Вт.) 20:00 The CW (# 308) Вторжение! (R)
11.07.17 (Вт) 20:00 The CW (# 307) Killer Frost (R)
04.07.17 (Вт) 20:00 The CW (# 306) Оттенок (R)
27.06.17 (Вт.) 20:00 The CW (# 305) Монстр (R)
20.06.17 (Вт.) 20:00 The CW (# 304) Новые разбойники (R)
13.06.17 (Вт) 20:00 The CW (# 303) Пурпурный (R)
06.06.17 (Вт) 20:00 The CW (# 302) Paradox (R)
30.05.17 (Вт.) 20:00 The CW (# 301) Flashpoint (R)
23.05.17 (Вт.) 20:00 CW (# 323) Финишная линия
16.05.17 (вт.) 20:00 The CW (# 322) ул. Инфантино
09.05.17 (Вт) 20:00 The CW (# 321) Причина и следствие
02.05.17 (Вт) 20:00 The CW (# 320) Я знаю, кто вы
25.04.17 (Вт.) 20:00 The CW (# 319) The Once and Future Flash
18.04.17 (Вт.) 20:00 The CW (# 314) Нападение на Центральный город (R)
11.04.17 (Вт.) 20:00 The CW (# 313) Атака на Горилла-Сити (R)
28.03.17 (Вт.) 20:00 The CW (# 318) Абра Кадабра
21.03.17 (Вт) 20:00 The CW (# 317) Дуэт
21.03.17 (Вт.) 20:00 The CW (# 317) Duet
14.03.17 (Вт.) 20:00 The CW (# 316) Into the Speed ​​Force
07.03.17 (Вт.) 20:00 The CW (# 315) Гнев Савитара
28.02.17 (Вт.) 20:00 CW (№ 314) Атака на Центральный город
21.02.17 (Вт.) 20:00 The CW (# 313) Атака на Город Гориллы
14.02.17 (Вт.) 21:00 The CW (# 312) Неприкасаемые (R)
07.02.17 (Вт) 20:00 The CW (# 312) Неприкасаемые
31.01.17 (Вт) 20:00 The CW (# 311) Мертвый или живой
24.01.17 (Вт) 20:00 The CW (# 310) Заимствование проблем из будущего
17.01.17 (Вт.) 20:00 The CW (# 309) Настоящее (R)
1/10/17 (Вт) 20:00 The CW (# 308) Вторжение! (R)
1/3/17 (Вт) 20:00 The CW (# 307) Killer Frost (R)
27.12.16 (Вт) 20:00 The CW (# 306) Оттенок (R)
13.12.16 (Вт.) 20:00 The CW (# 305) Monster (R)
06.12.16 (Вт.) 20:00 The CW (# 309) Настоящее
29.11.16 (Вт.) 20:00 The CW (# 308) Вторжение!
29.11.16 (Вт.) 20:00 The CW (# 308) Вторжение! (**)
29.11.16 (Вт.) 20:00 The CW (# 308) Вторжение!
22.11.16 (Вт.) 20:00 The CW (# 307) Killer Frost
15.11.16 (Вт.) 20:00 The CW (# 306) Оттенок
08.11.16 (Вт) 20:00 The CW (# 301) Flashpoint (R)
01.11.16 (Вт) 20:00 The CW (# 305) Монстр
25.10.16 (Вт) 20:00 The CW (# 304) Новые разбойники
18.10.16 (Вт) 20:00 The CW (# 303) Пурпурный
11.10.16 (Вт.) 20:00 The CW (# 302) Парадокс
04.10.16 (Вт) 20:00 The CW (# 301) Flashpoint
29.09.16 (чт) 20:00 The CW (# 223) Гонка его жизни (R)
27.09.16 (Вт.) 20:00 The CW (# 222) Invincible (R)
22.09.16 (чт) 20:00 The CW (# 221) Сбежавший динозавр (R)
20.09.2016 (Вт.) 20:00 CW (# 220) Разрыв (R)
15.09.16 (чт.) 20:00 The CW (# 219) Вернуться в нормальное состояние (R)
13.09.16 (Вт) 20:00 The CW (# 218) по сравнению с Zoom (R)
06.09.16 (Вт) 20:00 The CW (# 217) Flash Back (R)
30.08.16 (Вт.) 20:00 The CW (# 212) Fast Lane (R)
23.08.16 (Вт.) 20:00 The CW (# 211) Обратный возврат вспышки (R)
16.08.16 (Вт.) 20:00 The CW (# 210) Потенциальная энергия (R)
09.08.16 (Вт.) 20:00 The CW (# 209) Беги, чтобы стоять на месте (R)
26.07.16 (Вт) 20:00 The CW (# 209) Беги, чтобы стоять на месте (R)
19.07.16 (Вт.) 20:00 The CW (# 208) Легенды сегодняшнего дня (R)
12.07.16 (Вт) 20:00 The CW (# 207) Gorilla Warfare (R)
05.07.16 (Вт) 20:00 The CW (# 206) Enter Zoom (R)
28.06.16 (Вт.) 20:00 The CW (# 205) Тьма и свет (R)
21.06.16 (Вт.) 20:00 The CW (# 204) Ярость огненной бури (R)
14.06.16 (Вт) 20:00 The CW (# 203) Семья разбойников (R)
07.06.16 (Вт) 20:00 The CW (# 202) Вспышка двух миров (R)
31.05.16 (Вт.) 20:00 The CW (# 201) Человек, который спас Центр города (R)
26.05.16 (тыс.) 21:00 The CW (# 223) Гонка его жизни (R)
24.05.16 (Вт) 20:00 The CW (# 223) Гонка его жизни
24.05.16 (Вт.) 20:00 The CW (# 223) Гонка его жизни
17.05.16 (Вт.) 20:00 The CW (# 222) Invincible
10.05.16 (Вт.) 20:00 The CW (# 221) Беглый динозавр
03.05.16 (Вт.) 20:00 CW (# 220) Разрыв
26.04.16 (Вт) 20:00 The CW (# 219) Вернуться к нормальной жизни
19.04.16 (Вт) 20:00 The CW (# 218) по сравнению с Zoom
19.04.16 (Вт) 20:00 The CW (# 218) по сравнению с Zoom
05.04.16 (Вт.) 20:00 The CW (# 215) King Shark (R)
29.03.16 (Вт) 20:00 The CW (# 217) Flash Back
22.03.16 (Вт) 20:00 CW (# 216) Траектория
15.03.16 (Вт.) 20:00 The CW (# 214) Побег с Земли-2 (R)
08.03.16 (Вт.) 20:00 The CW (# 213) Добро пожаловать на Землю-2 (R)
23.02.16 (Вт.) 20:00 The CW (# 215) King Shark
16.02.16 (Вт) 20:00 The CW (# 214) Побег с Земли-2
09.02.16 (Вт) 20:00 The CW (# 213) Добро пожаловать на Землю-2
02.02.16 (Вт) 20:00 The CW (# 212) Fast Lane
26.01.16 (Вт) 20:00 The CW (# 211) Возврат обратной вспышки
19.01.16 (Вт.) 20:00 The CW (# 210) Потенциальная энергия
13.01.16 (ср.) 20:00 The CW (# 208) Легенды сегодняшнего дня (R)
1/5/16 (Вт) 20:00 The CW (# 205) Тьма и свет (R)
29.12.15 (Вт) 20:00 The CW (# 204) Ярость огненной бури (R)
22.12.15 (Вт.) 20:00 The CW (# 203) Семья разбойников (R)
15.12.15 (Вт.) 20:00 The CW (# 202) Вспышка двух миров (R)
08.12.15 (Вт.) 20:00 The CW (# 209) Бежим, чтобы стоять на месте
07.12.15 (Пн) 20:00 The CW (# 208) Легенды сегодняшнего дня (R)
01.12.15 (Вт.) 20:00 The CW (# 208) Легенды сегодняшнего дня
01.12.15 (Вт.) 20:00 The CW (# 208) Легенды сегодняшнего дня
24.11.15 (Вт) 21:00 The CW (# 201) Человек, который спас Централ Сити (R)
17.11.15 (Вт.) 20:00 The CW (# 207) Gorilla Warfare
10.11.15 (Вт.) 20:00 The CW (# 206) Введите масштаб
03.11.15 (Вт) 20:00 The CW (# 205) Тьма и свет
27.10.15 (Вт.) 20:00 The CW (# 204) Ярость огненной бури
20.10.15 (Вт.) 20:00 The CW (# 203) Семья разбойников
13.10.15 (Вт.) 20:00 The CW (# 202) Вспышка двух миров (**)
13.10.15 (Вт.) 20:00 The CW (# 202) Вспышка двух миров
06.10.15 (Вт.) 20:00 The CW (# 201) Человек, который спас центральный город
06.10.15 (Вт.) 20:00 The CW (# 201) Человек, который спас центральный город
01.10.15 (тыс.) 20:00 The CW (# 123) Достаточно быстро (R)
24.09.15 (чт) 20:00 The CW (# 122) Rogue Air (R)
22.09.15 (Вт) 21:00 The CW (# 121) Гродд жив (R)
22.09.15 (Вт.) 20:00 The CW (# 120) The Trap (R)
17.09.15 (чт) 20:00 The CW (# 119) Кто такой Харрисон Уэллс? (R)
15.09.15 (Вт.) 21:00 The CW (# 118) All Star Team Up (R)
15.09.15 (Вт.) 20:00 The CW (# 117) Трикстеры (R)
08.09.15 (Вт.) 20:00 The CW (# 116) Rogue Time (R)
01.09.15 (Вт) 20:00 The CW (# 115) Вне времени (R)
25.08.15 (Вт.) 20:00 The CW (# 114) Fallout (R)
18.08.15 (Вт.) 20:00 The CW (# 113) The Nuclear Man (R)
11.08.15 (Вт) 20:00 The CW (# 112) Crazy for You (R)
04.08.15 (Вт.) 20:00 The CW (# 111) The Sound and the Fury (R)
28.07.15 (Вт.) 20:00 The CW (# 110) Месть разбойников (R)
21.07.15 (Вт) 20:00 The CW (# 109) Человек в желтом костюме (R)
14.07.15 (Вт) 20:00 The CW (# 108) Flash Vs. Стрелка (R)
07.07.15 (Вт) 20:00 The CW (# 107) Отключение электроэнергии (R)
30.06.15 (Вт.) 20:00 The CW (# 106) Рождение Флэша (R)
23.06.15 (Вт) 20:00 The CW (# 105) Plastique (R)
16.06.15 (Вт.) 20:00 The CW (# 104) Going Rogue (R)
09.06.15 (Вт.) 20:00 The CW (# 103) Вещи, от которых вы не можете убежать (R)
02.06.15 (Вт.) 20:00 The CW (# 102) Самый быстрый человек в мире (R)
26.05.15 (Вт) 20:00 Пилот CW (# 101) (R)
19.05.15 (Вт) 20:00 The CW (# 123) Достаточно быстро
19.05.15 (Вт) 20:00 The CW (# 123) Достаточно быстро
12.05.15 (Вт) 20:00 The CW (# 122) Rogue Air
05.05.15 (Вт.) 20:00 The CW (# 121) Гродд жив
28.04.15 (Вт) 20:00 The CW (# 120) The Trap
21.04.15 (Вт.) 20:00 The CW (# 119) Кто такой Харрисон Уэллс?
14.04.15 (Вт) 20:00 The CW (# 118) All Star Team Up
14.04.15 (Вт) 20:00 The CW (# 118) All Star Team Up
09.04.15 (тыс.) 21:00 The CW (# 117) Трикстеры (R)
9.04.15 (чт) 20:00 The CW (# 116) Rogue Time (R)
07.04.15 (Вт) 20:00 The CW (# 115) Вне времени (R)
02.04.15 (чт.) 21:00 The CW (# 114) Fallout (R)
02.04.15 (чт) 20:00 The CW (# 113) Nuclear Man (R)
31.03.15 (Вт.) 20:00 The CW (# 117) Трикстеры
26.03.15 (чт.) 21:00 The CW (# 112) Crazy for You (R)
24.03.15 (Вт) 20:00 The CW (# 116) Rogue Time
17.03.15 (Вт) 20:00 The CW (# 115) Вне времени
10.03.15 (Вт) 20:00 The CW (# 112) Crazy for You (R)
03.03.15 (Вт.) 20:00 The CW (# 111) Звук и ярость (R)
24.02.15 (Вт.) 21:00 The CW (# 110) Месть разбойников (R)
17.02.15 (Вт.) 20:00 The CW (# 114) Fallout
10.02.15 (Вт) 20:00 The CW (# 113) The Nuclear Man
03.02.15 (Вт.) 20:00 The CW (# 112) Без ума от вас
27.01.15 (Вт.) 20:00 The CW (# 111) The Sound and the Fury
20.01.15 (Вт.) 20:00 The CW (# 110) Месть разбойников
14.01.15 (ср.) 21:00 The CW (# 109) Человек в желтом костюме (R)
13.01.15 (Вт.) 8:00 PM The CW (# 108) Flash vs. Arrow (R)
1/6/15 (Вт) 20:00 The CW (# 107) Отключение электроэнергии (R)
30.12.14 (Вт.) 20:00 The CW (# 106) The Flash is Born (R)
23.12.14 (Вт) 20:00 The CW (# 105) Plastique (R)
16.12.14 (Вт.) 20:00 The CW (# 104) Going Rogue (R)
09.12.14 (Вт) 20:00 The CW (# 109) Человек в желтом костюме
09.12.14 (Вт) 20:00 The CW (# 109) Человек в желтом костюме
02.12.14 (Вт.) 20:00 The CW (# 108) Flash vs. Arrow
02.12.14 (Вт.) 8:00 PM The CW (# 107) Flash vs. Arrow
25.11.14 (Вт) 20:00 The CW (# 107) Отключение электроэнергии
18.11.14 (Вт.) 20:00 The CW (# 106) The Flash is Born
11.11.14 (Вт) 20:00 The CW (# 105) Plastique
04.11.14 (Вт) 20:00 The CW (# 103) Вещи, от которых вы не можете убежать (R)
28.10.14 (Вт.) 20:00 The CW (# 104) Going Rogue (**)
28.10.14 (Вт) 20:00 The CW (# 104) Going Rogue
21.10.14 (Вт.) 20:00 The CW (# 103) Вещи, от которых нельзя убежать
15.10.14 (ср.) 21:00 The CW (# 102) Самый быстрый человек в живых (R)
15.10.14 (ср.) 21:00 The CW (# 101) Самый быстрый человек в мире (R)
14.10.14 (Вт) 20:00 The CW (# 102) Самый быстрый человек в мире
14.10.14 (Вт) 20:00 The CW (# 101) Самый быстрый человек в мире
08.10.14 (ср.) 21:00 Пилот CW (# 101) (R)
08.10.14 (ср.) 21:00 The CW (# 100) Город героев (R)
07.10.14 (Вт) 20:00 CW (# 101) Пилот
07.10.14 (Вт) 20:00 The CW (# 100) Город Героев
07.10.14 (Вт) 20:00 The CW (# 100) Город Героев

Взлет и падение Flash, раздражающего плагина, который сформировал современный Интернет

Flash по своей сути визуален, как и предполагал Гей.«У нас была простая модель анимации на основе кадров — вы могли начать с графики и рисунка, а затем постепенно добавлять и развивать навыки поведения», — говорит он. Он не считает успех Флэша неожиданностью. Он выполнял три функции, по которым тосковал онлайн-мир. Первым было общее стремление создать что-то более богатое, чем вы могли бы с помощью GIF или HTML: Flash предоставил платформу для коротких видео в Интернете. Второе — универсальность Flash, он работал в разных браузерах и на разных устройствах.

Третье, по словам Гей, заключается в том, что Flash позволяет дизайнерам, «людям с правым полушарием», создавать интерактивные медиа и доставлять их широкой аудитории. Flash привел визуальных художников в онлайн. «Вы можете связать визуализацию с программным действием, и когда ваша анимация зацикливается, ваше поведение тоже будет зацикливаться», — говорит Марти Спеллерберг, дизайнер, который участвовал в создании раннего Flash-сайта Halfempty.com. «Он связал эти две идеи вместе, что, я думаю, было важным зацепом для многих визуальных художников.Мы даже не знали, что программируем — мы думали, что просто изучаем Flash ».

Онлайн-мир, в который вошел Flash, был в основном статичным. Мигающие гифки приносят большую часть онлайн-движения. Созданные на ранних этапах HTML и CSS, веб-сайты неуклюже выросли из метафор журнального дизайна: квадратные и сетчатые, они имели границы, боковые панели и маленькие интерактивные числа, чтобы пролистывать свои страницы (ужас).

Flash все изменил. Это изменило внешний вид сети.Подобно тому, как ваше счастливое маленькое облако парило, как покачивались бедра Буша, веб-сайты получили жизнь. «Вспышка была звуковой; это было движение; это была интерактивность », — говорит Спеллерберг. «Это был Интернет, который изображали в фильмах, верно? Когда вы видите Интернет в поп-культуре, это динамичный, захватывающий опыт — вы можете создавать такие вещи с помощью Flash ».

Анимации могут быть ограничены интерактивным блоком на странице — небольшим видео или игрой на странице MySpace — или могут охватывать целые веб-сайты.«Это почти похоже на разницу между тем, что мы видим сегодня на консоли и похожей на виртуальную реальность», — соглашается Смолл. «Это был огромный скачок вперед с точки зрения изысканности, глубины и вовлеченности».

Некоторые из этих сайтов были, короче говоря, абсолютным мусором. Вспышка применялась с энтузиазмом и неуместно. Беспричинная анимация веб-сайтов ресторанов была особенно прискорбной — мерзости китча, они могли включать в себя громкую басовую музыку и телепортацию ингредиентов.«Путеводитель по электронной музыке» Ишкура — замечательный пример из той эпохи, которую вы все еще можете видеть — хаос из поп-артистических линий, пузырей и аудиосэмплов, он выглядит как карта разума непослушного ребенка.

Даже поистине великолепные образцы той эпохи, такие как Future Vision от Vodafone — изменяющаяся, мерцающая галлюцинация графики, видео и звука, предлагавшая, как продукты компании могут выглядеть через десять лет, — похоже, ожидают, что пользователи будут привлечены удовольствиями собственное исследование.«Это были лабиринты!» — говорит Спеллерберг. «Ни один бизнес сейчас не станет заказывать такую ​​вещь — у нас есть деловые ожидания в отношении вещей, и мы знаем, что работает». В отличие от современной деловой эстетики Интернета, есть что-то странное, почти сентиментальное в том, что транснациональные корпорации на миллиард долларов создают веб-сайты в соответствии с худшим излишеством Flash: длительное время загрузки, яркая мультяшная графика, навязчивый звук и непонятная цель.

«Хотя я люблю ту эпоху веб-дизайна, с ней много проблем», — говорит Солтер.«Это было совершенно недоступно, потому что во Flash не было метафоры страницы. Браузер, программы чтения с экрана, текст — все становится просто катастрофой. Если посмотреть на это с точки зрения архивистов или программы чтения с экрана, эти веб-сайты были во многих отношениях плохими, но они были забавными! »

Из всех этих веб-сайтов один имеет самое сильное наследие. Это породило бы понимание Интернета, который мы сейчас считаем само собой разумеющимся: как портал для безграничной аудитории, где люди и их творения могут быть увидены и оценены.

FLASH, проапоптотический белок, участвующий в активации каспазы-8, необходим для процессинга 3′-конца пре-мРНК гистонов

РЕЗЮМЕ

Процессинг 3′-конца пре-мРНК гистона требует U7 snRNP, который связывается ниже сайт расщепления и рекрутирует эндонуклеазу CPSF-73. U7 snRNP содержит уникальное кольцо Sm, в котором канонический белок SmD2 заменен на Lsm11. Мы использовали дрожжевую двугибридную систему для идентификации партнеров по связыванию Lsm11 и выбрали проапоптотический белок FLASH.FLASH человека взаимодействует с Lsm11 in vitro и стимулирует процессинг 3′-конца пре-мРНК гистонов в ядерных экстрактах млекопитающих. Мы также идентифицировали ортолог FLASH у Drosophila и продемонстрировали, что он взаимодействует с Lsm11 in vitro и in vivo. FLASH дрозофилы локализуется в телах гистонового локуса, и его истощение в клетках мух ингибирует U7-зависимый процессинг, приводящий к полиаденилированию мРНК гистонов. Эти результаты демонстрируют, что FLASH является важным фактором, необходимым для созревания 3′-конца мРНК гистонов как у позвоночных, так и у беспозвоночных, и предполагают потенциальную связь между этим процессом и апоптозом.

Ключевые слова: пре-мРНК гистонов, процессинг 3′-конца, U7 snRNP, Lsm11, FLASH, апоптоз

ВВЕДЕНИЕ

Процессинг 3′-конца предшественников мРНК (пре-мРНК) является важным этапом в создании зрелых мРНК и играет важную роль. важную роль в регуляции экспрессии генов на посттранскрипционном уровне. Для подавляющего большинства пре-мРНК процессинг 3′-конца происходит посредством расщепления / полиаденилирования, двухступенчатого механизма, в котором начальное эндонуклеолитическое расщепление ниже гексамера AAUAAA сопровождается добавлением поли (A) хвоста к новому сгенерировал 3′-конец (Zhao et al., 1999; Mandel et al., 2008). Единственным исключением из этого правила являются зависимые от репликации животных пре-мРНК гистонов, которые процессируются на 3′-конце за счет эндонуклеолитического расщепления, за которым не следует полиаденилирование (Dominski and Marzluff, 2007). Расщепление пре-мРНК гистонов происходит в пределах примерно 50-75 нуклеотидов 3 ‘от стоп-кодона в сайте, расположенном между высококонсервативной структурой стебель-петля и богатым пурином гистоновым нижележащим элементом (HDE). Образовавшаяся мРНК гистонов оканчивается стержневой петлей, за которой следует либо 4- (Drosophila), либо 5-нуклеотидный (млекопитающие) одноцепочечный хвост (Dominski and Marzluff, 2007).

Структура «стебель-петля», расположенная перед сайтом расщепления, образует плотный комплекс с белком, связывающим «стебель-петля» (SLBP), тогда как HDE взаимодействует с snRNP U7. U7 snRNP состоит из примерно 60-нуклеотидной мяРНК U7 и гептамерного кольца Sm, которое отличается от канонического кольца Sm, обнаруженного в сплайсосомных snRNP, наличием Lsm10 и Lsm11 вместо SmD1 и SmD2 (Schumperli and Pillai, 2004). . U7 snRNP связывает гистоновую пре-мРНК главным образом посредством взаимодействия спаривания оснований между 5′-концом мяРНК U7 и HDE, и связывание дополнительно стабилизируется взаимодействием между U7 snRNP и комплексом SLBP / стержень-петля.В клетках млекопитающих это взаимодействие, вероятно, опосредуется белком цинкового пальца 100 кДа (ZFP100), который, как было показано, взаимодействует как с U7 snRNP, так и с комплексом SLBP / стволовая петля (Dominski and Marzluff, 2007). Роль в процессинге 3′-конца пре-мРНК гистонов in vivo также постулируется для U2 snRNP, который взаимодействует с консервативной областью, присутствующей в большинстве мРНК гистонов (Friend et al., 2007), и для отрицательного фактора элонгации ( NELF), который образует комплекс с SLBP (Narita et al., 2007).

Расщепление пре-мРНК гистонов катализируется CPSF-73 (Dominski et al., 2005a), членом семейства металло-β-лактамаз цинк-зависимых гидролитических ферментов (Dominski, 2007). Для реакции также требуется симплекин, термочувствительный белок с неизвестной функцией (Kolev and Steitz, 2005), и CPSF-100, близкий гомолог и взаимодействующий партнер CPSF-73 (Dominski et al., 2005b; Wagner et al. , 2007). Интересно, что CPSF-73, CPSF-100 и симплекин были впервые идентифицированы как важные компоненты традиционного механизма процессинга 3′-концов, который генерирует полиаденилированные мРНК (Mandel et al., 2008; Гилмартин, 2005).

Неизвестно, как CPSF-73 рекрутируется в пре-мРНК гистонов. Одним из компонентов обрабатывающего комплекса, который, вероятно, прямо или косвенно участвует в этой задаче, является Lsm11. Lsm11 характеризуется необычно длинным N-концевым участком, который необходим для 3′-концевого расщепления пре-мРНК гистонов в ооцитах Xenopus (Schumperli and Pillai, 2004). Мы использовали дрожжевую двугибридную систему для скрининга библиотеки кДНК HeLa с человеческим Lsm11 и идентифицировали FLASH как белок, который взаимодействует с N-концевой областью Lsm11.Первоначально FLASH был описан как проапоптотический белок, необходимый для активации каспазы-8 через внешний путь, связанный с рецептором Fas (Imai et al., 1999). Впоследствии FLASH участвует в модуляции транскрипционной активности рецепторов стероидных гормонов и активации транскрипции как NF-κB (Krieghoff et al., 2007), так и онкогена c-Myb (Alm-Kristiansen et al., 2008). Важно отметить, что также было показано, что FLASH локализуется вблизи локусов гистоновых генов и необходим для прогрессирования S-фазы, что предполагает роль в экспрессии гистоновых генов (Barcaroli et al., 2006). Здесь мы демонстрируем, что FLASH выполняет эту роль в первую очередь, если не исключительно, в качестве важного фактора для 3′-концевого процессинга пре-мРНК гистонов. Мы также показываем, что эта роль сохраняется между позвоночными и беспозвоночными. FLASH, вероятно, занимает центральное место в процессинговом комплексе, рекрутируя и / или активируя CPSF-73, а также может играть критическую роль в интеграции экспрессии гистоновых генов с другими клеточными событиями, включая прогрессирование клеточного цикла и апоптоз.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Человеческий Lsm11 в качестве приманки в дрожжевой двугибридной системе

В процессинговом комплексе связывание snRNP U7 с HDE в пре-мРНК гистонов, как предполагается, приведет к положению Lsm11 рядом с сайтом расщепления (Yang et al. ., 2009) (). Человеческий Lsm11 представляет собой белок из 360 аминокислот, который можно разделить на две половины (). N-концевая половина из 170 аминокислот необычно длинна для белков семейства Sm и не содержит узнаваемых доменов (Schumperli and Pillai, 2004). С-концевая половина соответствует типичному белку Sm и содержит два консервативных мотива, Sm1 и Sm2, за которыми следует относительно короткий С-конец.

Последовательности и белки, участвующие в процессинге 3′-конца пре-мРНК гистона

A. Элементы последовательности в пре-мРНК гистона, необходимые для реакции расщепления.Гистоновый нижележащий элемент (HDE), который соединяется с 5′-концом мяРНК U7, подчеркнут, а сайт расщепления, расположенный через 5 нуклеотидов после стержневой петли, обозначен стрелкой. B. Предварительная конфигурация транс-действующих факторов, участвующих в процессинге 3′-конца пре-мРНК гистона (жирная серая линия). МяРНК U7 представлена ​​жирной черной линией. Стрелка указывает сайт, где CPSF-73 расщепляет пре-мРНК гистона. X символизирует неизвестный белок, который взаимодействует с N-концевой областью Lsm11 (обозначен пунктирной линией) и обеспечивает связь (вопросительный знак) с другими компонентами процесса обработки, включая эндонуклеазу CPSF-73.

FLASH взаимодействует с N-концевым доменом Lsm11

A. Доменная организация Lsm11 и схематическое изображение делеционных мутантов, используемых в направленной двугибридной системе дрожжей для картирования области взаимодействия с FLASH. B. Антитело, направленное против N-конца Lsm11, ингибирует расщепление пре-мРНК h3a в ядерном экстракте мыши (NE). Только субстрат показан на дорожке 1. Антитело против CPSF-73, которое не распознает CPSF-73 в ядерных экстрактах, использовали в качестве отрицательного контроля (дорожка 3).Направленную двугибридную систему дрожжей использовали для анализа взаимодействия различных фрагментов Lsm11, слитых с GAL4 DNA-BD, с N-концевым фрагментом FLASH, слитым с GAL4 AD. Звездочка указывает, что N-концевой фрагмент FLASH помещен вне кадра с GAL4 AD. Суспензии дрожжевых клеток, экспрессирующих Lsm11 и FLASH, наносили на контрольную чашку, содержащую гистидин, или на селективные чашки, не содержащие гистидин, и добавляли указанные концентрации 3-аминотриазола (3-AT).Планшеты анализировали через 3 дня инкубации при 27 ° C. D. Направленную двугибридную систему дрожжей использовали для анализа взаимодействия между N-концом FLASH человека (слева) и N-концом dFLASH дрозофилы (справа) либо с Lsm11 дрозофилы, либо с Lsm11 человека (верхний и нижний столбцы соответственно. ).

Мы создали антитело против N-концевых 170 аминокислот человеческого Lsm11, которое активно для вестерн-блоттинга (Yang et al., 2009) и иммуноокрашивания (Ghule et al., 2008).Важно отметить, что то же антитело при добавлении к ядерному экстракту мыши значительно снижало эффективность реакции расщепления (полоса 4). Т.о., эта часть Lsm11 д. Выполнять важную функцию в процессинге 3′-конца пре-мРНК гистонов в клетках млекопитающих. Антитело против N-конца CPSF-73, которое не распознает нативный CPSF-73 в ядерном экстракте (Dominski et al., 2005a), не влияет на процессинг (дорожка 3).

Ранее было показано, что

Lsm11 взаимодействует in vitro с ZFP100 ().Однако это взаимодействие не затрагивает высококонсервативные аминокислоты Lsm11, которые необходимы для процессинга 3′-концов (Azzouz et al., 2005). Таким образом, вероятно, существуют др. Белки, которые устанавливают важные контакты с N-концевой областью Lsm11. Для поиска этих белков мы провели скрининг библиотеки кДНК HeLa против полноразмерного человеческого Lsm11, слитого с ДНК-связывающим доменом GAL4 (GAL4 DNA-BD). Из почти 20 миллионов проверенных диплоидов менее 200 показали существенный рост на селективной среде, что позволяет предположить, что они могут экспрессировать белок, взаимодействующий с Lsm11.

Наиболее часто получаемые клоны (всего 7) содержали различные фрагменты кДНК, кодирующие N-концевую часть белка FLASH (для белка «Flice Associated Huge»), также известного как CASP8AP2 (для «белка 2, связанного с каспазой-8») (Имаи и др., 1999). Поразительно, что во всех этих клонах кДНК FLASH была слита вне рамки считывания с вышележащей областью, кодирующей домен активации GAL4 (AD), или содержала часть 5’UTR со стоп-кодоном в рамке считывания, который должен был препятствовать нормальной трансляции. области кодирования FLASH.Чтобы определить, представляют ли выбранные клоны FLASH ложноположительные результаты, мы субклонировали самую короткую выбранную кДНК, кодирующую первые 139 аминокислот FLASH в рамке с GAL4 AD, и повторно оценили взаимодействие этого слитого белка с Lsm11, используя дрожжевую двугибридную систему. Удивительно, но дрожжевые клетки, экспрессирующие слитый белок в рамке считывания, росли очень медленно, что делало практически невозможным тестирование взаимодействия с Lsm11. Этот результат предполагает, что высокий уровень экспрессии N-концевой части FLASH токсичен для дрожжевых клеток и что присутствие стоп-кодона или сдвиг рамки считывания эффективно снижает экспрессию слитого белка, таким образом сводя к минимуму его токсический эффект (рис.S2A).

Картирование области человеческого Lsm11, которая взаимодействует с N-концом FLASH

Клетки дрожжей, экспрессирующие N-концевой фрагмент FLASH вне рамки кадра (аминокислоты 1–139) и полноразмерный Lsm11, показали устойчивый рост в присутствие 100 мМ 3-аминотриазола (3-AT), что свидетельствует о сильном взаимодействии (, столбец 1). Мы провели направленные двухгибридные эксперименты для картирования области Lsm11, которая участвует во взаимодействии с N-концевой частью FLASH. Две половины Lsm11 отдельно клонировали в рамке с GAL4 DNA-BD и тестировали на взаимодействие с N-концом FLASH, слитого вне рамки считывания с GAL4 AD.Клетки дрожжей, экспрессирующие первые 170 аминокислот Lsm11, сохраняли способность к устойчивому росту в присутствии 100 мМ 3-AT, что позволяет предположить, что этой области достаточно для сильного взаимодействия с FLASH (столбец 3). Для дрожжевых клеток, экспрессирующих C-концевую половину Lsm11, почти не наблюдалось роста при самой низкой протестированной концентрации 3-AT (5 мМ) (столбец 2). Вестерн-блоттинг показал, что все три клона Lsm11 обнаруживались в дрожжевых клетках, причем уровень экспрессии С-концевой части превышал уровень экспрессии полноразмерного белка (не показан).На основании этих результатов мы заключаем, что N-концевой половины Lsm11 достаточно для взаимодействия с FLASH.

Делеция первых 40 аминокислот из N-концевой половины Lsm11 полностью подавляет рост дрожжевых клеток, демонстрируя, что остатки 1-40 необходимы для взаимодействия с FLASH (, столбец 4). Эта N-концевая область содержит кластер аминокислот (позиции 24-40), которые были высококонсервативными у позвоночных и дрозофилы и, вероятно, играют важную роль в процессинге 3′-конца пре-мРНК гистонов (рис.S1C).

Идентификация гомолога FLASH дрозофилы

Чтобы определить, сохранялось ли взаимодействие между Lsm11 и FLASH в процессе эволюции, мы использовали BLAST для поиска гомолога FLASH в базе данных NCBI дрозофилы. Только один белок дрозофилы, обозначенный как CG4616, демонстрировал слабое сходство последовательности с FLASH млекопитающих, при этом область гомологии ограничивалась первыми ~ 180 аминокислотами из 844 аминокислот (фиг. S1A и B). Основываясь на приведенных ниже функциональных данных, мы называем этот белок Drosophila FLASH (dFLASH).Мы клонировали первые 178 аминокислот dFLASH в рамке с GAL4 AD и протестировали его взаимодействие в дрожжевой двугибридной системе с полноразмерным Lsm11 дрозофилы, слитым с GAL4 DNA-BD (). Чтобы контролировать специфичность взаимодействия, мы также совместно экспрессировали каждый белок в гетерологичных комбинациях: N-концевую часть dFLASH с человеческим Lsm11 и Drosophila Lsm11 с N-концевым человеческим FLASH вне рамки считывания. Неожиданно дрожжевые клетки, экспрессирующие N-концевую часть dFLASH, также росли медленнее, и размещение вставки вне рамки с GAL4 AD восстановило нормальную скорость роста (рис.S2B). Этот результат предполагает, что N-концевая часть FLASH и dFLASH токсична для дрожжевых клеток. Поскольку ингибирующий эффект dFLASH не был таким пагубным, как эффект, вызванный FLASH, мы смогли провести направленные двухгибридные анализы с использованием N-концевого фрагмента белка дрозофилы, клонированного в рамке с GAL4 AD.

Способность дрожжевых клеток расти в присутствии 100 мМ 3-AT предполагает, что dFLASH тесно взаимодействует с Lsm11 дрозофилы (, верхний правый угол). Удивительно, но столь же сильное взаимодействие наблюдалось между гетерологичной парой dFLASH и человеческим Lsm11 (нижний правый угол), хотя в присутствии 25 мМ 3-AT не наблюдалось роста клеток, коэкспрессирующих N-концевую область человеческого FLASH и Drosophila Lsm11 (, верхний левый угол).

Взаимодействие in vitro между Lsm11 и N-концом FLASH

Затем мы проанализировали взаимодействие между человеческим Lsm11 и FLASH с использованием метода «pull-down» глутатион-S-трансферазы (GST). N-концевая часть FLASH (аминокислоты 1–139) была экспрессирована в E. coli как слитый белок с GST и протестирована на его способность связывать и разрушать различные части человеческого Lsm11, меченного метионином 35 S.

GST сам по себе не связывал 35 S-меченный человеческий Lsm11 или 3’hExo, белок того же размера, что и Lsm11, который использовали в качестве отрицательного контроля (дорожки 5 и 6).Напротив, слитый белок GST-FLASH связывал до 20% входящего полноразмерного Lsm11 (, дорожка 3), но не связывал 3’hExo (, дорожка 4). Эти результаты демонстрируют, что in vitro N-концевой фрагмент FLASH человека специфически взаимодействует с полноразмерным Lsm11 человека. Слитый белок GST-FLASH воспроизводимо разрушает 10-20% N-концевой половины Lsm11 (дорожка 2 и дорожка 2) и только фоновое количество C-концевой половины (дорожка 5). Только фоновое количество каждого фрагмента Lsm11 было разрушено контрольным слитым белком, GST-Mock (дорожки 3 и 6).Важно отметить, что делеция первых 40 аминокислот N-концевой половины Lsm11 устраняет взаимодействие с FLASH in vitro (дорожка 5). Эти данные согласуются с данными дрожжевого двугибридного анализа и демонстрируют, что FLASH взаимодействует с N-концевой половиной Lsm11 и что для взаимодействия требуются первые 40 аминокислот Lsm11.

FLASH человека и дрозофилы взаимодействуют с Lsm11 человека in vitro

A. Полноразмерные Lsm11 человека и 3’hExo были синтезированы и помечены трансляцией in vitro с помощью 35 S-метионина и инкубированы с гибридным белком, состоящим из GST и N- конечная часть FLASH (дорожки 3 и 4) или только с GST (дорожки 5 и 6).Дорожки 1 и 2 содержат по 20% каждого радиоактивного белка, использованного в анализе методом «pull-down». B. Способность слитых белков GST-FLASH и GST-Mock взаимодействовать с S-меченной 35 S-концевой половиной Lsm11 (дорожки 2 и 3) или С-концевой половиной (дорожки 5 и 6). Дорожки 1 и 4 содержат 20% каждого радиоактивного белка, использованного в анализе методом «выталкивания». C. Способность GST, слитого с N-концевой областью FLASH дрозофилы (GST-dFLASH), взаимодействовать с полноразмерной S-меченной 35 (дорожка 2) или С-концевой половиной Lsm11 человека (дорожка 4).Дорожки 1 и 3 содержат 20% каждого радиоактивного белка, использованного в анализе методом «выталкивания». D. Способность слитых белков GST-FLASH и GST-dFLASH взаимодействовать с S-меченной 35 S-концевой половиной (дорожки 2 и 3) или N-концевой половиной, в которой отсутствуют первые 40 аминокислот человеческого Lsm11 ( дорожки 5 и 6). Дорожки 1 и 4 содержат 20% каждого радиоактивного белка, использованного в анализе методом «выталкивания».

Слитый белок GST и N-концевая часть dFLASH связывает более 20% полной длины 35 S-меченного человеческого Lsm11 и только фоновое количество C-концевого фрагмента (дорожки 2 и 4, соответственно).Тот же самый слитый белок также связывал N-концевую часть человеческого Lsm11, и делеция первых 40 аминокислот из Lsm11 полностью устраняла связывание (дорожки 3 и 6, соответственно). Мы пришли к выводу, что FLASH и dFLASH связываются с одной и той же областью в N-концевой половине Lsm11 человека и не имеют существенных контактов с C-концевой половиной.

Истощение dFLASH активирует полиаденилирование репортерного гена в клетках дрозофилы

У дрозофилы истощение любого фактора, участвующего в U7-зависимом 3′-конце процессинга гистоновых пре-мРНК посредством РНКи или мутации, приводит к переключению на обычный механизм процессинга 3′-конца и накопления мРНК полиаденилированных гистонов (Wagner et al., 2007). Недавно на основе этого феномена была разработана схема скрининга всего генома для поиска новых процессинговых факторов у Drosophila (Wagner et al., 2007). В этой системе за фрагментом гена гистона h4 дрозофилы, содержащим все необходимые процессинговые последовательности, но без стоп-кодона, следует кодирующая последовательность зеленого флуоресцентного белка (GFP) и сигнал полиаденилирования в рамке считывания. Клетки дрозофилы, содержащие этот репортерный ген, обычно не экспрессируют GFP, поскольку U7-зависимое расщепление сразу после петли-ствола удаляет кодирующую область GFP из гибридной пре-мРНК.Однако любой дефект в U7-зависимом процессинге приводит к транскрипции в ORF GFP и экспрессии GFP, тем самым превращая клетки Drosophila в зеленый цвет.

Чтобы определить, участвует ли dFLASH в процессинге 3′-конца пре-мРНК гистонов, мы создали две двухцепочечные (ds) РНК, каждая длиной примерно 500 пар оснований, нацеленных на разные области в пределах открытой рамки считывания dFLASH. Поскольку было возможно, что dFLASH также необходим для транскрипции гистоновых генов, мы использовали клетки дрозофилы, стабильно экспрессирующие репортерный ген, управляемый конститутивным промотором гена актина 5C, а не промотором гистонового гена ().Клетки Drosophila D.Mel-2, экспрессирующие репортерный ген, обрабатывали отдельно каждой из двух дцРНК dFLASH и анализировали на экспрессию GFP. Двухцепочечная РНК против белка, связывающего полипиримидиновый тракт (PTB), известного фактора сплайсинга, была использована в качестве отрицательного контроля, тогда как дцРНК против SLBP, важного 3′-концевого фактора процессинга, была использована в качестве положительного контроля. Клетки дрозофилы, обработанные в течение 3 дней дцРНК, нацеленной на SLBP, были явно GFP-положительными, тогда как клетки, обработанные дцРНК против PTB, не экспрессировали детектируемых уровней GFP ().Наиболее важно то, что клетки D.Mel-2, обработанные любой из двух dFLASH-специфичных дцРНК, проявляли устойчивую флуоресценцию, предполагая, что dFLASH необходим для 3′-концевого процессинга гистоновых пре-РНК in vivo.

Подавление dFLASH в клетках дрозофилы с помощью РНКи активирует экспрессию репортерного гена GFP

A. Схема репортерного гена, содержащего промотор актина 5C, область, кодирующую первые 67 аминокислот гистона h4 дрозофилы, часть гистона h4 3 ‘UTR, включая стержень-петлю и HDE, а также ORF GFP в кадре.U7-зависимый сайт расщепления (CS) и сигнал полиА от гена OpIE2 указаны стрелками. B. Флуоресцентные изображения клеток D.Mel-2, экспрессирующих репортерный ген, после трех дней обработки двухцепочечных РНК против указанных мРНК. C. Анализ RT-PCR различных мРНК, выделенных из клеток D.Mel-2, обработанных двухцепочечными РНК, как указано вверху. Тотальную РНК выделяли из обработанных клеток и амплифицировали с помощью ПЦР с (+) или без (-) предварительной обратной транскрипции (RT).

Для контроля эффективности РНКи мы использовали ОТ-ПЦР анализ общей РНК, выделенной из клеток после трех дней обработки дцРНК. Мы также проанализировали неправильную обработку репортерной мРНК и эндогенных мРНК гистонов с использованием прямых праймеров для ПЦР в пределах ORF h4 и обратных праймеров, нацеленных либо на ORF GFP, либо на область, расположенную ниже U7-зависимого сайта расщепления, соответственно. Анализ RT-PCR подтвердил, что мРНК dSLBP и dFLASH подавлялись соответствующими дцРНК, тогда как неродственная мРНК, кодирующая тубулин, не была затронута ().Как репортерная пре-мРНК, так и эндогенные пре-мРНК h3a и h3b были неправильно обработаны в клетках, обработанных дцРНК против dSLBP и против dFLASH, о чем судили по накоплению видов РНК, выходящих за пределы структуры петли стебля (). Неправильная обработка была также очевидна для трех других мРНК гистонов (не показаны). Общие уровни мРНК h3a и h3b существенно не изменились в клетках, содержащих неправильно обработанную мРНК, демонстрируя, что снижение нормального U7-зависимого процессинга эффективно компенсировалось переключением на расщепление / полиаденилирование.

Прямое обнаружение неправильно обработанных мРНК эндогенных гистонов

Неправильно обработанные мРНК эндогенных гистонов, содержащие полиА-хвост, можно легко разделить из правильно расщепленных мРНК гистонов с терминами «стебель-петля» с помощью гель-электрофореза, при этом неправильно обработанные мРНК длиннее и неоднородны по размеру. Мы обрабатывали клетки D.Mel-2 дцРНК против dFLASH и других факторов, участвующих в процессинге 3′-конца пре-мРНК гистонов, и анализировали общую РНК из обработанных клеток с помощью Нозерн-блоттинга.В качестве отрицательного контроля мы использовали нацеленные на дцРНК белки, участвующие в других процессах обработки РНК. Когда это было возможно, уровень белков с пониженной регуляцией контролировали с помощью специфических антител. После 5 дней лечения дцРНК против dSLBP клетки D.Mel-2 не содержали детектируемого dSLBP (, ​​дорожка 6), а большая часть мРНК гистона h4 дрозофилы была полиаденилирована и обнаружена как мазок, мигрирующий медленнее, чем петля ствола. прекращенный вид (, дорожка 3).

Получение мРНК полиденилированных гистонов в клетках дрозофилы в отсутствие dFLASH

A.Вестерн-блоттинг лизатов из необработанных клеток D.Mel-2 (дорожка 1) или клеток, обработанных указанными дцРНК, включая dFLASH # 1 (дорожка 2), которая нацелена на вышестоящую область мРНК dFLASH. Блот зондировали антителом против дсимплекина (верхняя панель) или антителом против SLBP (нижняя панель). Полоса CR на нижней панели соответствует перекрестно реагирующему белку, который обнаруживается антителом против SLBP и служит в качестве внутреннего контроля нагрузки. Б. Вестерн-блоттинг лизатов необработанных D.Клетки Mel-2 (дорожка 1) или клетки, обработанные дцРНК dFLASH # 1 (дорожка 2). Аликвоту ядерного экстракта (NE) из клеток Drosophila Kc анализировали на дорожке 1. Блот анализировали антителом против dFLASH. Полоса CR соответствует перекрестно реагирующему белку, который обнаруживается антителом против dFLASH в лизатах цельных клеток D.Mel-2, но не в Kc NE. C. Нозерн-блот-анализ общей РНК, выделенной из клеток D.Mel-2, протестированных на панелях A и B. Блот гибридизовали с 32 P-меченными зондами, направленными против мРНК гистона дрозофилы h4 (dh4) (верхняя панель) и Дрозофила 7SK РНК для контроля для равной нагрузки (нижняя панель).D. Вестерн-блоттинг-анализ лизатов необработанных клеток D.Mel-2 (дорожка 1) или клеток, обработанных указанными дцРНК, включая dFLASH # 2 (дорожка 4), которая нацелена на нижележащую область мРНК dFLASH. Блот анализировали антителом против dsymplekin (верхняя панель), антителом против dSLBP (средняя панель) и антителом против dFLASH (нижняя панель). E. Нозерн-блот-анализ общей РНК, выделенной из клеток D.Mel-2, протестированных на панели D. Блот гибридизовали с меченным Р 32 зондом, направленным против мРНК гистона h4 дрозофилы.Справа показана передержка части пленки, содержащей полосы 2–6.

В соответствии с результатами анализа GFP, клетки D.Mel-2, подвергшиеся в течение 5 дней воздействию дцРНК # 1 против dFLASH, накапливали легко обнаруживаемое количество мРНК полиаденилированного гистона h4 (, дорожка 5). Мы создали антитело против первых 178 аминокислот белка dFLASH и наблюдали, что белок, мигрирующий с массой около 150 кДа и наиболее вероятно соответствующий dFLASH, отсутствовал в обработанном экстракте (дорожка 3).Эта подвижность была значительно ниже, чем ожидалось для dFLASH (95 кДа). Синтез dFLASH с использованием системы трансляции in vitro подтвердил, что этот белок обладает необычной электрофоретической подвижностью и действительно мигрирует при ~ 150 кДа (рис. S3).

Другой эффект был замечен для двух других факторов, участвующих в процессинге 3′-конца пре-мРНК гистонов: симплекин и CPSF-73. Эти два белка также необходимы для расщепления / полиаденилирования и, следовательно, их истощения специфическими дцРНК при ингибировании правильного U7-зависимого процессинга, в то же время предотвращает эффективное полиаденилирование мРНК гистонов (дорожки 4 и 6).Появление мРНК полиаденилированных гистонов в клетках, лишенных CPSF-73 и симплекина, можно обнаружить только после продолжительного времени воздействия (правая панель, дорожка 5). В клетках D.Mel-2, обработанных дцРНК против RC-68, который является гомологом CPSF-73, участвующим в процессинге 3′-конца пре-мяРНК, не наблюдалось обнаруживаемых изменений в паттерне процессинга пре-мРНК гистонов, или в необработанных клетках после 5 дней культивирования (дорожки 1 и 2). В соответствии с результатами анализа RT-PCR () общий уровень мРНК h4 не снижался в клетках, лишенных dFLASH (, дорожка 5), что позволяет предположить, что dFLASH не играет роли в транскрипции гистоновых генов.Для контроля равной нагрузки тот же Нозерн-блот зондировали против РНК 7SK Drosophila, РНК из 550 нуклеотидов, синтезируемой РНК-полимеразой III (нижняя панель).

Мы повторили эксперимент с РНКи, используя дцРНК, нацеленную на другую область мРНК dFLASH (dFLASH # 2). Мы также использовали дцРНК, нацеленную на другую область мРНК dsymplekin (Symp # 2), и дцРНК, которая нацелена на dtRNase Z, эндонуклеазу, участвующую в процессинге 3′-конца пре-тРНК, в качестве отрицательного контроля. Результаты этого эксперимента с РНКи были идентичны тем, которые наблюдались в первом эксперименте, с дцРНК анти-SLBP и анти-dFLASH # 2, приводящими к надежному полиаденилированию мРНК h4 (дорожки 4 и 6), а дцРНК нацелена на дтРНКазу. Z не действует (, дорожка 2).Уровень белка dFLASH был значительно снижен только в клетках D.Mel-2, обработанных дцРНК против dFLASH # 2 (, дорожка 4). Такой же селективный эффект на уровни белка наблюдался для дцРНК, направленных против SLBP и симплекина (дорожки 2 и 3).

В целом, эти результаты убедительно подтверждают представление о том, что Drosophila FLASH является фактором, участвующим в процессинге 3′-конца пре-мРНК гистонов in vivo. Более того, наблюдение, что истощение FLASH дрозофилы приводит к генерации легко обнаруживаемых уровней мРНК полиаденилированных гистонов, предполагает, что FLASH, в отличие от CPSF-73 и симплекина, участвует только в процессинге 3′-конца пре-мРНК гистонов и не играет никакой роли в генерация полиаденилированных мРНК.Неожиданно, несмотря на устойчивое полиаденилирование гистоновых мРНК, постоянно наблюдаемое в dFLASH-дефицитных клетках, dFLASH ускользнул от детекции как 3′-концевой фактор процессинга в исходном полногеномном репортерном скрининге (Wagner et al., 2007). Возможно, что некоторые факторы были упущены из виду при скрининге из-за более низкого качества дцРНК и / или дцРНК, нацеленных на участки мРНК, более устойчивые к РНКи.

dFLASH взаимодействует с Lsm11 in vivo и локализуется в тельцах гистонового локуса

Мы проанализировали внутриклеточную локализацию dFLASH у D.Клетки Mel-2. Ядра эмбрионов Drosophila содержат сайты концентрированных U7 snRNP, которые собираются вблизи локусов гистоновых генов (Liu et al., 2006). Эти сайты отличаются от тельцов Кахаля и были обозначены как тельца гистонового локуса (HLB). HLB в S-фазе клеток дрозофилы распознаются моноклональными антителами MPM-2, которые взаимодействуют с неидентифицированными фосфопротеинами дрозофилы (White et al., 2007). Мы исследовали, колокализуется ли dFLASH с эпитопом MPM-2, путем совместного окрашивания клеток D.Mel-2 кроличьим антителом против dFLASH и мышиным моноклональным антителом MPM-2.В большинстве клеток антитело против dFLASH обнаруживало единственную ярко выраженную структуру на ядро, при этом остальная часть ядра проявляла более диффузное окрашивание (). Мы также часто наблюдали ядра с двумя, реже тремя структурами, содержащими концентрированный dFLASH. Что еще более важно, структуры, содержащие dFLASH, на 100% совпадали со структурами, содержащими эпитоп MPM-2, демонстрируя, что dFLASH локализован в HLB (). В дополнение к ядрам с обоими белками, колокализованными в HLB, мы наблюдали ядра, которые содержали структуры dFLASH, но не имели обнаруживаемых структур, окрашенных MPM-2 (), и ядра, которые не проявляли какого-либо очагового окрашивания ни одним из антител (не показано).Вероятно, что первый класс представляет клетки в ранней фазе G1 до фосфорилирования эпитопа MPM-2. Клетки другого класса могут находиться в поздней фазе G2, когда HLB разбираются. Различное количество структур, обнаруживаемых с помощью антител против dFLASH и MPM-2, вероятно, отражает статус спаривания гомологичных хромосом (White et al., 2007) и / или присутствие дополнительных локусов гистоновых генов в некоторых клетках.

dFLASH взаимодействует с dLsm11 in vivo и локализуется в тельцах гистонового локуса

A.Иммунофлуоресцентные изображения клеток Drosophila D.Mel-2, косвенно окрашенных как моноклональным антителом MPM-2 (красный), так и антителом против dFLASH (зеленый). Ядра визуализировали с помощью DAPI. Четыре разных клетки D.Mel-2 представляют четыре разных образца совместного окрашивания, наблюдаемые с антителами MPM-2 и анти-dFLASH. Полоса соответствует 10 мкм. B. Вестерн-блот-анализ белков, осажденных из лизатов клеток Kc Drosophila, с использованием антител против dSLBP (дорожка 2) или анти-dFLASH (дорожка 3). Белки детектировали с использованием антител против dFLASH (верхняя панель), анти-dSLBP (средняя панель) или анти-dLsm11 (нижняя панель).Вводимый лизат (1%) показан на дорожке 1. Продукты разложения dFLASH (Deg) обозначены скобками. С. Верхняя панель: Вестерн-блот-анализ белков, осажденных из лизатов клеток Drosophila Kc, с использованием антител анти-dLsm11 (дорожка 2), анти-dSLBP (дорожка 3) или анти-dFLASH (дорожка 4). Белки детектировали с помощью антитела против dFLASH. Вводимый лизат (1%) показан на дорожке 1. Нижняя панель: фракцию преципитатов анализировали Нозерн-блоттингом на присутствие мяРНК Drosophila U7 (dU7). «Deg» представляет собой продукт деградации мяРНК U7, осажденной антителом против dLsm11.D. Нозерн-блоттинг-анализ dU7 мяРНК, выделенной из необработанных клеток D.Mel-2 (дорожка 1) или клеток D.Mel-2, обработанных указанными дцРНК (дорожки 2-6). Виды перекрестно реагирующей РНК, указанные вверху (CR), служили в качестве контроля загрузки. E. Процессинг 3′-конца пре-мРНК гистона дрозофилы h4 (dh4) in vitro в ядерном экстракте из клеток Kc. Обработку проводили в контрольных условиях (дорожка 2) или в присутствии указанных антител, очищенных от белка А (дорожки 3 и 4), и / или 1 мкг N-концевого белка dFLASH, слитого с GST (дорожки 5 и 6).Дорожка 1 содержит входной субстрат dh4.

Мы проверили, может ли антитело против dFLASH со-преципитировать Lsm11 дрозофилы (dLsm11), который также находится в HLB (Liu et al., 2006), или dSLBP, фактор обработки, который демонстрирует более диффузную картину окрашивания по всей нуклеоплазме. (Lanzotti et al., 2004). Клетки Kc дрозофилы лизировали в присутствии 0,5% буфера NP-40 и инкубировали с антителом против dFLASH или с антителом против dSLBP. Как определено вестерн-блоттингом с использованием антитела против dFLASH, в некоторых экспериментах большая часть белка dFLASH подвергалась значительному протеолизу во время иммунопреципитации (верхняя панель, дорожка 3).Однако независимо от этой деградации осадок неизменно был обогащен dLsm11 (нижняя панель, дорожка 3), что указывает на то, что эти два белка образуют стабильный комплекс в клетках Drosophila Kc. Обратите внимание, что антитело против dLsm11 обнаруживает две близко мигрирующие формы dLsm11 в экстрактах дрозофилы (нижняя панель, дорожка 1), и эти две формы присутствовали в преципитате анти-dFLASH (дорожка 3).

В отличие от dLsm11, не обнаруживаемое количество dSLBP не осаждалось антителом против dFLASH, что позволяет предположить, что только ограниченное количество факторов процессинга стабильно связывается с dFLASH (средняя панель, дорожка 3).Антитело против dSLBP специфически преципитировало dSLBP (средняя панель, дорожка 2). Однако осадок не содержал какого-либо детектируемого количества dFLASH или dLsm11, что дополнительно подтверждает, что dSLBP не является частью стабильного комплекса с двумя другими факторами обработки. Мы использовали обратный подход и обнаружили, что анти-dLsm11 осаждает dFLASH (верхняя панель, дорожка 2), хотя, как и ожидалось, количество осажденного белка было ниже по сравнению с количеством, осажденным антителом против dFLASH (дорожка 4).Опять же, антитело против dSLBP не преципитировало никакой dFLASH (верхняя панель, дорожка 3).

Мы использовали Нозерн-блоттинг для тестирования фракции каждого преципитата, показанного на верхней панели, на присутствие мяРНК U7 дрозофилы (мяРНК dU7). Как и ожидалось, осадок анти-dLsm11 был обогащен мяРНК dU7 (нижняя панель, дорожка 2). Напротив, антитело против dSLBP не смогло осаждать мяРНК dU7, что согласуется с его неспособностью осаждать dLsm11 (нижняя панель, дорожка 3). Важно отметить, что антитело против dFLASH осаждает по меньшей мере столько же мяРНК dU7, сколько и антитело против Lsm11 (нижняя панель, дорожка 4).Таким образом, dFLASH образует плотный комплекс со всем snRNP U7, а не только с dLsm11.

Чтобы проверить, является ли dFLASH неотъемлемой частью мяРНП U7, мы проанализировали уровень мяРНК dU7 в клетках D.Mel-2, лишенных Drosophila symplekin, SLBP, FLASH () и Lsm11 (рис. S4, дорожка 2). РНКи-опосредованное истощение Lsm11 приводит к легко обнаруживаемому полиаденилированию пре-мРНК гистонов (рис. S4, дорожка 2). Более того, истощение dLsm11, как ожидалось для стабильного компонента U7-специфичного кольца Sm, привело к почти полному исчезновению dU7 snRNA (, дорожка 6).Напротив, истощение dsymplekin и dFLASH только умеренно снижает уровень dU7 snRNA (дорожки 2 и 4-5), а истощение dSLBP не оказывает никакого эффекта (дорожка 3). Мы пришли к выводу, что dFLASH не требуется для целостности snRNP dU7.

Мы исследовали, ингибирует ли антитело против dFLASH процессинг 3′-конца в ядерном экстракте из клеток Drosophila Kc, используя в качестве отрицательного контроля антитело против человеческого FLASH (см. Ниже). Важно отметить, что очищенный от белка А анти-dFLASH полностью блокировал процессинг субстрата гистона h4 дрозофилы (дорожка 4), тогда как антитело против N-концевого FLASH человека не имело эффекта (дорожка 3).Добавление конкурирующего N-концевого белка dFLASH, слитого с GST (белок, который был использован для генерации антитела), полностью обращал отрицательный эффект антитела против dFLASH, доказывая, что эффект был специфическим (, дорожка 6). Таким образом, dFLASH необходим для 3′-концевого процессинга пре-мРНК гистонов в ядерных экстрактах дрозофилы.

FLASH необходим для in vitro 3′-концевого процессинга пре-мРНК гистонов млекопитающих

В клетках человека FLASH присутствует в ядерных фокусах, которые на 100% совпадают со структурами, содержащими NPAT, коактиватор 220 кДа гистоновых генов ( Barcaroli et al., 2006; Bongiorno-Borbone et al., 2008). Поскольку NPAT локализуется рядом с кластерами гистоновых генов (Ma et al., 2000; Zhao et al., 2000), эти структуры рассматриваются как тела гистонового локуса (HLBs). Помимо NPAT, HLBs млекопитающих также содержат U7 snRNP с двумя его уникальными компонентами, Lsm10 и Lsm11 (Ghule et al., 2008). HLB часто связаны, хотя и не идентичны, с коилин-содержащими тельцами Кахаля (CB), и степень совместной локализации зависит как от типа клетки (первичная против трансформированной), так и от фазы клеточного цикла (Bongiorno-Borbone et al., 2008).

Мы создали кроличьи антитела против N-концевой области человеческого FLASH (аминокислоты 1–139), слитые с GST, и протестировали его активность в экспериментах по иммунофлуоресценции для анализа внутриклеточной локализации FLASH в клетках HeLa. Антитело окрашивало ряд ядерных структур в клетках HeLa, которые лишь изредка перекрывались с тельцами Кахаля, обнаруженными с помощью антитела против коилина (вверху). Важно отметить, что ядерные структуры, окрашенные антителом против FLASH, совместно локализованы с NPAT-положительными структурами (внизу).Таким образом, как ранее было показано с другими антителами против FLASH (Barcaroli et al., 2006; Bongiorno-Borbone et al., 2008), человеческий FLASH локализуется в HLB.

FLASH локализуется в телах гистонового локуса и требуется для 3′-конца процессинга в ядерных экстрактах млекопитающих

A. Иммунофлуоресцентные изображения клеток HeLa, косвенно окрашенных поликлональным антителом против FLASH (зеленый) и либо моноклональным антителом против коилина (красный), либо моноклональные антитела против NPAT (красный). Ядра визуализировали с помощью DAPI.Стрелка указывает на совместную локализацию тел Кахала и FLASH. Полоса соответствует 10 мкм. B. Антитело против FLASH ингибирует in vitro процессинг 3′-конца пре-мРНК гистона h3a мыши в ядерном экстракте из клеток миеломы мыши. Обработку проводили в контрольных условиях (дорожки 2 и 8) или в присутствии антител, очищенных от протеина А (А) или аффинно очищенных (Р), как указано в верхней части каждой дорожки. Реакции процессинга, показанные на дорожках 11 и 13, содержат как антитело, так и 1 мкг конкурирующего N-концевого FLASH (аминокислоты 1–139), слитого с GST, тогда как реакция процессинга, показанная на дорожке 9, содержит только 1 мкг белка.Дорожки 1 и 7 содержат входной субстрат h3a. C. N-концевой фрагмент FLASH человека стимулирует процессинг 3′-конца пре-мРНК гистона h3a в 0,75 мкл ядерного экстракта миеломы мыши (дорожки 2–5) и в 7,5 мкл ядерного экстракта HeLa (дорожки 7– 8). Обработку проводили в контрольных условиях (дорожки 2 и 7), в присутствии 40 нг N-концевого FLASH человека (дорожки 3 и 8) или в присутствии 40 нг контрольных слитых белков GST (дорожки 4 и 5). D. Стимуляция процессинга 3′-конца в 1 мкл ядерного экстракта мыши N-концевым фрагментом FLASH человека (40 нг) в отсутствие (дорожка 3) или в присутствии молярного избытка РНК стебель-петля. (полоса 5).E. Комплексы процессинга собирали на 5′-биотинилированной пре-мРНК гистона (0,25 мкг) в нормальных условиях (дорожки 2 и 6) или в присутствии олигонуклеотида против mU7 (дорожки 3 и 7) и очищали на стрептавидиновых гранулах. Наличие отдельных белков, связанных с пре-мРНК гистонов, выявляли с помощью специфических антител. Комплексы процессинга, проанализированные на дорожках 6 и 7, были собраны в ядерном экстракте мыши, дополненном N-концевым фрагментом FLASH. CR указывают на перекрестно реагирующие белки, распознаваемые антителом против Lsm11 (дорожка 1) или антителом против FLASH (дорожка 4 и 5).

Затем мы проверили способность антител против FLASH напрямую ингибировать реакцию обработки in vitro. Очищенное протеином А антитело против FLASH снижает эффективность процессинга пре-мРНК h3a в ядерном экстракте мыши с 80–95% (дорожки 2 и 8) до менее 20% (дорожки 3 и 10), в то время как белок Очищенные А-антитела против 3’hExo и dFLASH не оказывали эффекта (дорожки 4 и 5). Очищенное от белка А антитело против N-концевой области Lsm11 было столь же эффективным в ингибировании процессинга, как и антитело против FLASH (полоса 6).Бактериально экспрессируемый N-концевой FLASH, слитый с GST, полностью нейтрализовал ингибирующий эффект очищенного от белка A антитела против FLASH (дорожка 11), демонстрируя, что ингибирование является результатом блокирования антителом FLASH, присутствующего в экстракте. Аффинно очищенное антитело против FLASH также сильно ингибировало процессинг in vitro в ядерном экстракте мыши, и его ингибирующий эффект полностью нейтрализовался N-концевым фрагментом FLASH, слитым с GST (дорожки 12 и 13, соответственно). В целом, эти данные демонстрируют, что FLASH локализуется в HLBs и необходим для 3′-концевого процессинга пре-мРНК гистонов в ядерных экстрактах млекопитающих.

N-концевой участок FLASH стимулирует процессинг in vitro

Бактериально экспрессируемый N-концевой фрагмент человеческого FLASH (аминокислоты 1–139), слитый с GST, умеренно стимулировал расщепление субстрата h3a мыши (сравните дорожки 8 и 9). ). Мы изучили этот эффект более подробно, используя субоптимальные количества ядерных экстрактов мыши в реакции обработки. Снижение количества очень активного ядерного экстракта мыши с 7,5 мкл до 0,75 мкл на реакцию привело к резкому снижению эффективности обработки с ~ 95% (, дорожка 8) до ~ 10% (, дорожка 2).Примечательно, что добавление 40 нг рекомбинантного N-концевого FLASH, слитого с GST, восстановило эффективность расщепления до более чем 75% (дорожка 3), а стимулирующий эффект наблюдался всего с 4 нг рекомбинантного белка (рис. S5). Добавление самого GST (не показано) или контрольных слитых белков GST, включая dFLASH, не оказало влияния на процессинг (дорожки 4 и 5).

Мы также использовали 7,5 мкл слабоактивного ядерного экстракта HeLa и наблюдали сильную стимуляцию процессинга 40 нг N-концевого фрагмента FLASH (дорожки 7 и 8).Таким образом, как в ядерных экстрактах человека, так и мыши, FLASH является ограничивающим фактором. Что еще более важно, эти результаты демонстрируют, что этот короткий фрагмент (аминокислоты 1–139) поддерживает все необходимые функции FLASH человека в процессинге 3′-конца пре-мРНК гистонов in vitro. Поскольку SLBP является вспомогательным фактором, который улучшает связывание мяРНП U7 с пре-мРНК гистонов в ядерных экстрактах млекопитающих (Dominski and Marzluff, 2007), возможно, что этот белок опосредует стимулирующий эффект FLASH. Мы проверили, функционирует ли N-концевой FLASH в ядерном экстракте мыши, содержащем большой избыток РНК «стебель-петля».Эта РНК прочно связывает SLBP, присутствующий в экстракте, и снижает эффективность процессинга пре-мРНК h3a (сравните дорожки 2 и 4). Важно отметить, что FLASH стимулировал процессинг 3′-конца в присутствии РНК «стебель-петля» (сравните дорожки 4 и 5). Мы пришли к выводу, что стимулирующий эффект FLASH не зависит от SLBP и, скорее всего, достигается за счет привлечения другого, еще не охарактеризованного фактора обработки 3 ‘конца.

Затем мы спросили, может ли FLASH взаимодействовать с Lsm11 в комплексе процессинга гистоновых пре-мРНК.Мы инкубировали 5′-биотинилированную пре-мРНК гистона (0,25 мкг) в ядерном экстракте мыши (750 мкл) для сборки стабильных процессинговых комплексов, содержащих U7 snRNP (Yang et al., 2009). Реакцию сборки проводили в присутствии 0,1% NP-40 для ингибирования реакции расщепления, и обрабатывающие комплексы очищали путем связывания с гранулами стрептавидин-сефарозы. В качестве отрицательного контроля одна реакция содержала 2′-O-метилолигонуклеотид (анти-mU7), который блокирует 5′-конец мяРНК U7 и ингибирует рекрутирование мяРНП U7 в пре-мРНК гистона (, дорожка 3).В соответствии с нашими предыдущими результатами (Yang et al., 2009), Lsm11 был обнаружен вестерн-блоттингом только в реакции сборки, в которой отсутствует олигонуклеотид против mU7 (, дорожка 2). Удивительно, но в том же очищенном образце не удалось обнаружить FLASH, предположительно из-за низких концентраций эндогенного FLASH (не показано). Поэтому мы повторили эксперимент, используя ядерный экстракт мыши (750 мкл) с добавлением N-концевого FLASH (7,5 мкг) (дорожки 4 и 5). Рекомбинантный белок легко обнаруживался в процессинговых комплексах, собранных в нормальных условиях (нижняя панель, дорожка 6), и отсутствовал, когда связывание мяРНП U7 с пре-мРНК гистона предотвращалось олигонуцеотидом против mU7 (дорожка 7).Важно отметить, что пре-мРНК 5′-биотинилированного гистона была очищена в обеих реакциях с одинаковой эффективностью, о чем свидетельствует присутствие такого же количества SLBP, который связывает петлю стебля в субстрате независимо от мяРНП U7 (верхняя панель , дорожки 6 и 7). Мы пришли к выводу, что N-терминальный FLASH (1–139) взаимодействует с Lsm11 в контексте комплекса предварительной обработки, содержащего полный U7 snRNP, и что FLASH ограничивает ядерные экстракты млекопитающих.

ОБСУЖДЕНИЕ

Превращение зависимых от репликации пре-мРНК гистонов в мРНК гистонов требует единственного эндонуклеолитического расщепления для образования зрелого 3′-конца.Эта реакция процессинга 3′-конца направляется U7 snRNP, который связывается ниже сайта расщепления и рекрутирует 3′-эндонуклеазу CPSF-73 (Dominski and Marzluff, 2007). Наиболее отличительной особенностью snRNP U7 является состав его Sm кольца, которое содержит Lsm11 и Lsm10, а не SmD1 и SmD2, обнаруженные в сплайсосомных snRNPs (Schumperli and Pillai, 2004). По сравнению с другими белками семейства Sm, Lsm11 имеет необычно длинный N-концевой домен, который важен для процессинга 3′-конца пре-мРНК гистонов.Здесь мы показываем, что N-концевой домен Lsm11 взаимодействует с FLASH и что FLASH необходим для 3′-концевого процессинга пре-мРНК гистонов у позвоночных и беспозвоночных.

FLASH (для «FLICE-ассоциированного огромного» белка), также известного как CASP8AP2 (для «ассоциированного с каспазой-8 белка 2»), первоначально был идентифицирован как белок, который связывает и активирует каспазу-8 в ответ на активацию Fas / Рецепторы CD95 (Imai et al., 1999). Впоследствии было показано, что FLASH локализуется в ядерных структурах, также содержащих NPAT (Barcaroli et al., 2006), которые собираются вблизи локусов гистоновых генов на хромосомах 1 и 6 (Ma et al., 2000; Zhao et al., 2000) и теперь называются тельцами гистоновых локусов (HLBs). В клетках, стимулированных к апоптозу активацией рецептора Fas / CDC95, FLASH перемещается из ядерных тел в цитоплазму (Milovic-Holm et al., 2007). В цитоплазме FLASH преимущественно нацелен на митохондрии, где он связывается и, вероятно, активирует каспазу-8, тем самым запуская апоптоз. В соответствии с этим истощение FLASH из-за интерференции РНК ингибирует апоптоз, индуцированный CD95.В митохондриях FLASH и каспаза-8 могут образовывать тройной комплекс с антиапоптотическим аденовирусным белком E1B19K, и образование этого комплекса делает клетки устойчивыми к Fas / CD95-опосредованному апоптозу (Milovic-Holm et al., 2007).

Локализация FLASH в HLB впервые указала на возможную роль FLASH в экспрессии гистоновых генов, интерпретация, подтвержденная наблюдением, что подавление FLASH с помощью RNAi приводит к задержке прогрессирования S-фазы и снижению экспрессии гистоновых генов ( Barcaroli et al., 2006). Наши результаты демонстрируют, что FLASH участвует в экспрессии гистоновых генов, играя важную роль в процессинге 3′-конца пре-мРНК гистонов. FLASH и Lsm11 тесно взаимодействуют друг с другом через свои N-концевые области как в дрожжевой двугибридной системе, так и in vitro. Благодаря очень ограниченному сходству последовательностей мы идентифицировали ортолог человеческого FLASH у дрозофилы (dFLASH). dFLASH взаимодействует с Lsm11 дрозофилы, и это взаимодействие может быть легко обнаружено в клетках дрозофилы и in vitro.N-концевой фрагмент человеческого FLASH эффективно рекрутируется в пре-мРНК гистонов с помощью мяРНП U7, и антитела к dFLASH осаждают мяРНК U7 из экстрактов дрозофилы. Эти результаты показывают, что FLASH и dFLASH могут взаимодействовать с Lsm11 в контексте полностью собранного кольца Sm. FLASH и dFLASH локализуются в HLB, и истощение dFLASH в клетках Drosophila приводит к устойчивому полиаденилированию мРНК гистонов, указывая на то, что dFLASH необходим для 3′-концевого процессинга пре-мРНК гистонов in vivo.Кроме того, эксперименты по ингибированию антител показывают, что оба ортолога необходимы для 3′-концевого процессинга пре-мРНК гистонов in vitro.

Все биохимические потребности FLASH человека для функционирования в процессинге пре-мРНК гистонов in vitro обеспечиваются первыми 139 аминокислотами из общего числа аминокислот 1982 года. Добавление этого фрагмента к ядерным экстрактам млекопитающих стимулирует процессинг 3′-конца, указывая на то, что FLASH является ограничивающим фактором процессинга. Эта интерпретация подтверждается нашей предыдущей неспособностью обнаружить FLASH в процессинговых комплексах, собранных на пре-мРНК гистонов, с использованием больших количеств высокоактивного ядерного экстракта мыши (Yang et al., 2009).

Какова биохимическая функция FLASH в процессинге 3′-конца пре-мРНК гистонов и обоснование включения проапоптотического белка в этот критический этап экспрессии гистонового гена? Стимуляция процессинга 3′-конца не зависит от SLBP и, следовательно, не происходит за счет более эффективного рекрутирования U7 snRNP на гистоновую пре-мРНК. Поэтому правдоподобная гипотеза состоит в том, что одна область в N-концевом фрагменте FLASH взаимодействует с Lsm11, тогда как другая область устанавливает контакты с неидентифицированным компонентом процессингового аппарата, который, в свою очередь, связывается с 3′-эндонуклеазой CPSF-73.